学术报告厅

１ 材料与方法
１．１ 材料
　　共轭亚油酸：购于中国青岛澳海生物有限公司，其中ｃ９，ｔ１１－１８２ 含量为３８．１７％，ｔ１０，ｃ１２－１８２含量为４２．２５％。胰岛素放免试剂盒：德普公司。血糖仪及试纸：美国强生公司。游离脂肪酸试剂盒：德国Ｒｏｃｈｅ公司
１．２ 实验动物和饲料
　　８０～１００ｇ雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠购于上海医学院实验动物中心，观察一周后，按体重将动物随机分为５组，每组１０只，即基础对照组、高脂组及ＣＬＡ高、中、低剂量组每１００ｇ饲料中含ＣＬＡ分别为３．００ｇ、１．５０ｇ、０．７５ｇ，每周称重一次，记录给食量和撒食量，饲料构成见表１。于第１２周末乙醚麻醉处死动物（处死前１２ｈ空腹），腹主动脉采血，检测游离脂肪酸、血糖、胰岛素，取睾周和肾周脂肪称重记录，并留取睾周脂肪迅速放入液氮中冷冻以备检测ｍＲＮＡ。

１．３ 脂体比的计算
　　脂体比＝睾周脂肪重量（ｇ）＋肾周脂肪重量（ｇ）体重（ｇ）×１００
１．４ 游离脂肪酸测定
　　按试剂盒说明进行。
１．５ 胰岛素测定
　　放免法，按试剂盒说明进行。
１．６ 血糖测定
　　取一滴血用血糖仪（试纸）测全血血糖。
１．７ ＰＰＡＲγ、ａｐ２ ｍＲＮＡ测定
　　按ＧＩＢＣＯ公司总ＲＮＡ提取试剂盒的操作步骤，从１００ｍｇ大鼠白色脂肪组织中提取总ＲＮＡ，逆转录反应以总ＲＮＡ２μｇ为模板，ＰＰＡＲγ、ａｐ２和β－ａｃｔｉｎ基因采用ＯｌｉｇｏＤＴ为逆转录引物，加入逆转录酶ＡＭＶ１０Ｕ，总反应体系为２０μｌ，４２℃水浴２ｈ，合成第一条ｃＤＮＡ链，ＰＣＲ反应以逆转录产物２μｌ为模板，引物序列见表２，加入引物２０ｐｍｏｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．３５μｌ，总反应体系为２５μｌ，ＰＣＲ扩增条件为：β－ａｃｔｉｎ为９４℃变性３０ｓ、５７℃退火３０ｓ、７２℃延伸４０ｓ ３０个循环；ＰＰＡＲγ为９４℃变性３０ｓ、６５℃退火３０ｓ、７２℃延伸４０ｓ，３５个循环；ａｐ２为９５℃变性３０ｓ、５３℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环。ＰＣＲ产物经２％琼脂糖凝胶电泳，并与ＤＮＡ标准分子比较鉴定之后，在数字成相仪上照相，扫描分析。

１．８ 结果分析
　　运用ＳＡＳ６．１２软件包，数据以均数±标准差（Ｘ±ｓ）来描述，组间差异采用方差分析进行处理。

２ 结果
２．１ ＣＬＡ对大鼠体重、脂体比的影响
　　结果见表３。

　　由表３可见，各组大鼠初始体重没有显著性差异，基础组终末体重、脂体比低于高脂组，Ｐ＜０．０５。ＣＬＡ组随剂量增加，体重和脂体比逐渐下降，ＣＬＡ各剂量组与高脂组比Ｐ＜０．０５。
２．２ ＣＬＡ对大鼠胰岛素、血糖、游离脂肪酸的影响结果见表４。

　　由表４可见，与基础对照组比较，高脂组大鼠血清游离脂肪酸水平显著增加，而且高脂组大鼠血糖及血清胰岛素水平明显增高，胰岛素敏感性指数下降，经统计学分析，Ｐ＜０．０５，说明高脂饮食诱导的肥胖大鼠出现了胰岛素抵抗。而ＣＬＡ组大鼠血清游离脂肪酸、胰岛素及血糖水平与高脂组相比明显下降，胰岛素敏感指数明显增加，Ｐ＜０．０５，说明ＣＬＡ具有降低游离脂肪酸水平，改善胰岛素抵抗的作用。
２．３ ＣＬＡ对大鼠脂肪组织ＰＰＡＲγ、ａｐ２ ｍＲＮＡ基因表达的影响
１大鼠脂肪组织ＰＰＡＲγｍＲＮＡ的表达
　　由图１和图２的光密度扫描结果可见，高脂组大鼠白色脂肪组织ＰＰＡＲγ ｍＲＮＡ表达水平略高于基础组，ＣＬＡ组大鼠白色脂肪组织ＰＰＡＲγ ｍＲＮＡ的表达水平随剂量增加逐渐增强，且明显高于高脂组。

２大鼠脂肪组织ａｐ２ ｍＲＮＡ的表达
　　由图３和图４可见，高脂组大鼠脂肪组织ａｐ２ ｍＲＮＡ的表达高于基础组，ＣＬＡ各实验组大鼠ａｐ２ ｍＲＮＡ表达较高脂组明显增加，且随着剂量的升高，其表达也逐渐增强。

３ 讨论
　　肥胖者脂肪组织增加后，机体由于自身的稳态调节作用，增多的脂肪组织更趋向于代谢分解，造成ＦＦＡ进一步增高，高浓度的ＦＦＡ可通过多种途径影响胰岛素的作用及葡萄糖代谢，与胰岛素抵抗的发生有密切关系。因此降低ＦＦＡ、研究脂代谢机制对于改善胰岛素抵抗、预防２型糖尿病的发生具有重要意义。
　　本研究结果显示，各组动物实验前体重无显著性差异（Ｐ＞０．０５），试验结束时高脂饮食组大鼠体重、脂体比明显高于基础组Ｐ＜０．０５，说明高脂饮食诱导大鼠出现了肥胖，而ＣＬＡ各剂量组大鼠体重、脂体比明显低于高脂组大鼠（Ｐ＜０．０５），且有剂量反应关系，说明ＣＬＡ具有降低体重的作用。肥胖可导致脂类代谢异常。
　　本实验结果表明，高脂组大鼠血糖和血清ＦＦＡ水平明显高于基础组（Ｐ＜０．０５），根据葡萄糖脂肪酸循环学说３，ＦＦＡ与葡萄糖之间存在着氧化竞争。肥胖时ＦＦＡ增加，导致脂肪酸β氧化增强，抑制葡萄糖的氧化和酵解，从而引起血糖升高。血糖升高可进一步刺激胰岛素的释放，因而可导致高胰岛素血症。过量分泌的胰岛素不能维持正常的血糖水平，就产生了胰岛素抵抗。胰岛素抵抗表现为胰岛素敏感性降低，胰岛素敏感性指数是反映胰岛素抵抗的较好的指标。本实验结果显示，高脂组大鼠血糖、胰岛素水平显著高于基础组（Ｐ＜０．０５），胰岛素敏感性指数显著低于基础组（Ｐ＜０．０５），形成了高胰岛素血症和胰岛素抵抗。而ＣＬＡ各组血糖和ＦＦＡ较高脂组明显降低，且有剂量反应关系，说明ＣＬＡ可通过降低ＦＦＡ，减少其与葡萄糖氧化的竞争，发挥其降血糖作用。另外，ＣＬＡ各组动物胰岛素水平显著低于高脂组（Ｐ＜０．０５），胰岛素敏感性指数显著高于高脂组（Ｐ＜０．０５），说明ＣＬＡ具有显著的降胰岛素作用，可通过提高胰岛素敏感性指数，增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。
　　ＰＰＡＲγ是诱导脂肪细胞分化的关键调控因子，与ＰＰＡＲγ配基结合后可被激活，调节体内许多与糖代谢和脂代谢有关的基因转录，从而发挥抗糖尿病作用。已经确认，ａｐ２是ＰＰＡＲγ下游的涉及到脂类储存并调节脂类代谢的靶基因，脂肪组织ＰＰＡＲγ表达的增减可能会影响该目标基因的表达，继而影响能量代谢的平衡。
　　细胞吸收脂肪酸包括主动扩散和被动转运两种情况。在生理浓度范围内，９０％以上的脂肪酸经过蛋白转运途径进行转运４。一些脂类分子在细胞内外液体环境中的水溶性差，但对生命细胞有重要意义，脂肪酸结合蛋白可增加它们的溶解性，并负责它们的转运。脂肪酸在胞质内由脂肪酸结合蛋白转运。脂肪酸结合蛋白的结构特点决定了它对亲脂类化合物有亲和性，一个蛋白可结合两个疏水分子。长链脂肪酸在细胞内与脂肪酸结合蛋白结合后，增加了水溶性，可被迅速转运到脂肪酸氧化等位点发挥作用。脂肪酸结合蛋白在脂肪酸的吸收和利用，以及保持脂代谢稳定方面起重要作用。Ｂｉｎａｓ等５利用基因打靶技术建立了Ｈ－ＦＡＢＰ缺陷型鼠模型，该鼠表现为对外周长链脂肪酸利用缺陷。Ａｔｓｈａｖｅｓ等６发现，高水平的饱和脂肪酸和支链脂肪酸可引起脂类堆积，对细胞产生脂毒作用，细胞内尤其是脂肪细胞内脂肪酸结合蛋白ａｐ２的高表达可刺激脂肪细胞摄入ＦＦＡ，减少脂类堆积，削弱它对细胞的毒作用。
　　由于ＰＰＡＲγ在脂肪组织分化中起关键作用，可增加胰岛素敏感性，因此设想肥胖致胰岛素抵抗可能与ＰＰＡＲγ在体内的表达失调或降低有关。但本研究结果表明，高脂组大鼠脂肪组织ＰＰＡＲγｍＲＮＡ表达较基础组大鼠略有增加，我们认为肥胖鼠ＰＰＡＲγｍＲＮＡ表达增加可能是机体为了维持正常的胰岛素敏感性而出现的代偿现象，而ＣＬＡ各组大鼠脂肪组织ＰＰＡＲγｍＲＮＡ表达较高脂组明显增加，且随着剂量的增加，其表达增强，说明ＣＬＡ可激活ＰＰＡＲγ，而高脂组大鼠ＰＰＡＲγｍＲＮＡ表达的相对不足是产生胰岛素抵抗的原因之一。
　　由大鼠脂肪组织ａｐ２基因表达的情况可以看出，高脂组大鼠脂肪组织ａｐ２ ｍＲＮＡ表达略高于基础组。与高脂组过高的ＦＦＡ相比，脂肪组织这些基因的表达相对不足，刺激脂肪细胞摄入ＦＦＡ的能力有限，可能是高脂组大鼠血清ＦＦＡ过高、产生胰岛素抵抗的的原因之一。与高脂组相比，ＣＬＡ各实验组大鼠脂肪组织ａｐ２ ｍＲＮＡ表达均明显增加，且有剂量反应关系，并与ＰＰＡＲγ ｍＲＮＡ的表达趋势一致，说明ＣＬＡ可通过激活ＰＰＡＲγ上调ａｐ２ ｍＲＮＡ基因的表达，增加脂肪组织对ＦＦＡ的摄入，降低循环中ＦＦＡ的浓度，减少ＦＦＡ达到骨骼肌的浓度。正常情况下，骨骼肌是负责葡萄糖利用的主要组织，而肝脏和脂肪组织仅仅最低限度地（＜１０％）促进葡萄糖的利用，因此，ＣＬＡ可通过上述机制改善胰岛素抵抗、发挥抗糖尿病作用。

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