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周小建１ 王卫平２ 杨 毅２ １ 上海交通大学附属第一人民医院儿内科，上海 ２０００８０,２ 复旦大学儿科医院，上海 ２０００３２)
摘要：目的 维生素Ａ缺乏仍是发展中国家儿童的常见病严重威胁儿童的健康。给予足量的维生素Ａ可有效预防感染性疾病并降低死亡率，这种作用可能与维生素Ａ及其活性代谢产物视黄酸ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡ的免疫调节作用有关。维生素Ａ对免疫系统的影响正日益被人们所关注。本研究通过检测胸腺细胞发育过程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达变化，并观察视黄酸对其表达的影响，初步探讨Ｎｏｔｃｈ１信号途径在视黄酸对胸腺细胞分化发育中的作用。方法 采用胸腺组织体外培养的方法，在培养中加入视黄酸受体活化剂－全反式视黄酸ａｔＲＡ或视黄酸受体拮抗剂－Ｒｏ４１ ５２５３。在培养的不同时间收集Ｔ细胞，用荧光标记的抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体染色，应用流式细胞仪进行分析，观察胸腺细胞成熟分化表面标志的变化。实时定量ＰＣＲ检测培养过程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达变化。结果 采用流式细胞仪分析视黄酸受体的活化与阻抑对胸腺细胞成熟分化的影响，结果显示，在加入ＲＡ激活视黄酸受体后 ２４ｈ，ＣＤ４＋胸腺细胞明显增加，与对照组相比差异显著Ｐ＜０．０５。胸腺细胞表达Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ，实时定量ＰＣＲ结果显示，在ａｔＲＡ作用下，胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达在培养２４ｈ即明显下降，与ＣＤ＋胸腺细胞的变化负相关。结论 视黄酸能下调胸腺细胞表达Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ，Ｎｏｔｃｈ１信号途径可能参与了视黄酸对胸腺细胞发育的调节作用。
关键词：视黄酸；受体；胸腺细胞； Ｎｏｔｃｈ１；基因
维生素Ａ缺乏症仍是发展中国家儿童的常见病，严重威胁儿童的健康。维生素Ａ缺乏的儿童易患各种感染性疾病，给予足量的维生素Ａ可有效预防感染性疾病并降低死亡率，这种作用可能与维生素Ａ及其活性代谢产物视黄酸ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡ的免疫调节作用有关。实验证明类维生素Ａ对Ｔ、Ｂ淋巴细胞均有作用，维生素Ａ通过与其受体ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓＲＡＲ结合而发挥作用。我们既往的研究中也发现ＲＡ通过ＲＡＲα途径促进ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ４＋细胞分化，抑制其向ＣＤ８＋细胞分化１，但其机制尚不清楚。近年研究发现，Ｎｏｔｃｈｓ受体的表达与活化在淋巴细胞的发育中起重要作用２ Ｎｏｔｃｈ是一组跨膜受体，在多种器官及细胞的发育中起作用，主要决定细胞的分化方向３。在哺乳动物中共发现４类Ｎｏｔｃｈ基因，编码４种Ｎｏｔｃｈ受体，分别为Ｎｏｔｃｈ１～４。在Ｎｏｔｃｈ受体家族中，Ｎｏｔｃｈ１与Ｔ淋巴细胞的发育密切相关。ＲＡ对人胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１基因的表达有无作用，以及ＲＡ对胸腺细胞发育的调节作用是否与Ｎｏｔｃｈ１途径有关，尚未见报道。故我们通过检测胸腺细胞发育过程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达变化，并观察ＲＡ对其表达的影响，探讨ＲＡ对胸腺细胞分化发育的作用机制。
１ 材料与方法
１．１ 标本来源 ８例胸腺组织来源于复旦大学儿科医院先天性心脏病儿童在进行心脏修补手术时为暴露手术视野切除之部分胸腺，年龄均小于１岁。所有儿童均为单纯房缺或室缺，心功能和生长发育良好，其母怀孕期间无维生素缺乏病史。在取标本期间未接受任何影响免疫功能的治疗，如放射、激素及免疫抑制治疗等。
１．２ 胸腺组织培养与细胞表面标志分析 参照文献４，并按加入的培养液的不同分为空白对照组ｃｏｎｔｒｏｌＣ、视黄酸组ＲＡ、ＲＡ＋ Ｒｏ４１－５２５３组ＡＯ组，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中，各组均分别培养２４、４８、７２ｈ，并在各时间点分离收集胸腺细胞，制成细胞悬液，加荧光标记的抗ＣＤ４、ＣＤ８单克隆抗体染色后，并同时用荧光标记的抗ＣＤ３单克隆抗体染色作为分选指标，用流式细胞仪ＦＡＣＳｃａｎ ＢＤ公司分析结果。
１．３ 总ＲＮＡ抽提及逆转录ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ ＲＴＰＣＲ：取各时间点胸腺细胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ抽提总ＲＮＡ，操作按试剂盒说明进行并逆转录合成ｃＤＮＡ，扩增，并进行实时定量ＰＣＲ 分析。
１．４ 数据处理：应用ＳＰＳＳ统计软件进行处理。采用双因素方差分析，并进行相关分析。以均数±标准差Ｘ±ｓ表示，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。
２ 结果
２．１ 视黄酸受体活化与阻抑对胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表达的影响
我们试验中发现胸腺细胞与胸腺基质细胞均表达Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ图１。实时定量ＰＣＲ结果显示，正常对照组胸腺细胞在体外培养７２ｈ的过程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ并无明显变化，但在ａｔＲＡ活化视黄酸受体后，胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达在培养２４ｈ即明显下降，与同一时间点对照组比差异有显著性Ｐ＝０．０４７，并能持续到培养７２ｈ；加入ＲＡＲα受体特异性拮抗剂Ｒｏ４１ ５２５３并不能完全拮抗ａｔＲＡ对胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表达的下调作用图２。
２．２ Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表达与胸腺细胞表型分化的关系
体外培养过程中胸腺细胞各种表型的变化：采用流式细胞仪分析视黄酸受体的活化与阻抑对胸腺细胞成熟分化的影响，结果显示，在加入ＲＡ激活视黄酸受体后 ２４ｈ，ＣＤ４＋胸腺细胞明显增加，与对照组相比差异显著Ｐ＜０．０５；这种作用在加入视黄酸受体α的特异性拮抗剂Ｒｏ４１ ５２５３后则消失，与同时间点对照组无差异图３。但另一方面，视黄酸受体被活化后ＣＤ８＋细胞的百分数却降低，而该作用可被ＲＡＲα受体特异性拮抗剂所抑制图４。
我们发现ＲＡ组胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ表达变化在培养２４ｈ下降，而此时该组ＣＤ４＋百分数的变化在培养２４ｈ则上升，二者变化趋势相反。在体外培养２４－４８ｈ ＲＡ组ＣＤ８＋细胞的百分数下降图４，该时间点胸腺细胞Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达均维持在较低水平，但无明显相关性。
３ 讨论
Ｎｏｔｃｈｓ受体的表达与活化在淋巴细胞的发育中起重要作用１，在Ｎｏｔｃｈ受体家族中，Ｎｏｔｃｈ１与Ｔ淋巴细胞的发育密切相关。故我们通过检测胸腺细胞发育过程中Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达变化，探讨维生素Ａ对胸腺细胞分化发育的作用机制。
Ｎｏｔｃｈ１在胸腺细胞不同的分化阶段的表达变化对维持胸腺细胞的正常发育至关重要。Ｈａｓｓｅｒｊｉａｎ等２发现，胸腺细胞在由ＣＤ４－ＣＤ８－向ＣＤ４＋ＣＤ８＋的分化过程中，Ｎｏｔｃｈ１的表达下调，这对维持早期胸腺细胞的分化发育可能有重要意义。由于持续表达活化的Ｎｏｔｃｈ１蛋白能抑制正常皮质胸腺细胞的分化，导致Ｔ细胞白血病５，故在ＣＤ４＋ＣＤ８＋阶段的Ｎｏｔｃｈ１表达下调可能有利于ＣＤ４＋ＣＤ８＋细胞的进一步分化。
近年研究发现，表达持续活化的Ｎｏｔｃｈ１可促进ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞倾向于向ＣＤ８＋分化发育，抑制向ＣＤ４＋方向分化６。反义抑制内源性Ｎｏｔｃｈ１有利于ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的发育７。故我们推测，本研究中加ＲＡ后ＣＤ４＋细胞在培养２４ｈ后有所增加，可能由于ＲＡ抑制了Ｎｏｔｃｈ１的表达，使胸腺细胞向ＣＤ４＋、ＣＤ８＋的分化发生偏离，有利于ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ４＋方向分化，抑制其向ＣＤ８＋分化。
总之，我们的研究显示，视黄酸能促进促进ＣＤ４＋细胞的发育，抑制Ｎｏｔｃｈ１ ｍＲＮＡ的表达，视黄酸对胸腺细胞分化的调节作用，可能与其抑制Ｎｏｔｃｈ１信号途径有关。由于ＣＤ４＋细胞在细胞免疫以及活化辅助Ｂ细胞产生抗体的过程中均发挥重要作用，本研究为临床合理使用维生素Ａ制剂增强儿童免疫功能提供了理论依据。
参考文献：
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