|
周小建 王卫平 杨 毅(上海交通大学附属第一人民医院儿内科，上海 ２０００８０；复旦大学儿科医院，上海 ２０００３２)
摘要: 目的 研究视黄酸调节胸腺细胞发育的作用及其机制。方法 采用体外胸腺组织培养体系，在培养中加入视黄酸或视黄酸受体拮抗剂。在培养的不同时间收集胸腺细胞，用荧光标记的抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体染色，并进行流式细胞仪分析，观察胸腺细胞表面标志随成熟分化的变化。胸腺细胞抽提的ＲＮＡ采用实时定量ＰＣＲ法检测视黄酸受体αＲＡＲα ｍＲＮＡ的表达。结果 体外胸腺组织培养体系能支持胸腺细胞的发育成熟。在培养２４ｈ视黄酸促进未成熟的ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ４＋成熟细胞分化发育作用明显，并且该作用可被ＲＡＲα特异性拮抗剂Ｒｏ４１５２５３所拮抗。另一方面，视黄酸能显著抑制ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ８＋细胞分化，这种作用也在培养２４ｈ出现。实时定量ＰＣＲ结果显示，视黄酸能促进ＲＡＲα ｍＲＮＡ的表达，并且ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达水平与ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞百分数之间存在正相关ｒ＝０．５９３Ｐ＝０．０４２，与ＣＤ８＋胸腺细胞百分数之间存在负相关ｒ＝－０．６５４，Ｐ＝０．０２１。结论 视黄酸影响胸腺细胞的成熟分化，可能通过影响其受体ＲＡＲα表达的途径而发挥调节作用。
Erpression of Retinoic Acid Receptor Genes in Children'sThumus
ZHOU Xiao-jian, YANG Yi, WANG Wei-ping
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄＲＡ ｏｎ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｙｍｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＲＡ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ｔｈｙｍｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ／ｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ． Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ ２４ ４８ ａｎｄ ７２ ｈｏｕｒｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉＣＤ３ ａｎｔｉＣＤ４ ａｎｔｉＣＤ８ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ＲＡＲα ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡ ｔｏ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｍｍａｔｕｒｅ ＣＤ４＋ＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍａｔｕｒｅ ＣＤ４＋ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｍｍａｔｕｒｅ ＣＤ４＋ＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｍａｔｕｒｅ ＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ｍａｒｋｅｄ ａｔ ２４ｈ ａｎｄ ｗａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｒｏ４１５２５３． ＲＡ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＲα ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ． Ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＲα ｍＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４＋ＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓ ｒ＝０．５９３ Ｐ＝０．０４２． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＲα ｍＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓ ｒ＝－０．６５４，Ｐ＝０．０２１ ｂｙ ＲＡ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＲＡ ｌｉｋｅｌｙ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｅｒｈａｐｓ ｂｙ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＡＲα ｇｅｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｒｅｔｉｎｏｌ；Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ
胸腺是Ｔ淋巴细胞发育的重要场所，骨髓中的造血干细胞分化为共同淋巴样前体细胞ｃｏｍｍｏｎ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ＣＬＰ后进入胸腺，在胸腺微环境的作用下进一步发育为Ｔ淋巴细胞，Ｔ淋巴细胞在离开胸腺之前又称为胸腺细胞。Ｔ细胞在胸腺内的发育是胸腺细胞与胸腺微环境相互作用的结果，胸腺基质细胞通过分泌细胞因子，影响胸腺细胞的发育。视黄酸ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＲＡ是维生素Ａ代谢的主要活性产物，通过与视黄酸受体ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒＲＡＲ结合，在脊椎动物发育、胚胎形成、细胞分化中发挥重要作用。研究证实视黄酸对免疫功能具有重要的调节作用，但对免疫细胞成熟发育的影响及其作用机理尚有待进一步研究。本研究通过观察人胸腺细胞发育过程中细胞成熟分化表面标志的变化及其与ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达水平的相互关系，探讨ＲＡ影响胸腺细胞发育的作用及机制。
1 材料与方法
标本来源 胸腺组织来源于我院先天性心脏病儿童在进行心脏修补手术时为暴露手术视野切除之部分胸腺，所有儿童均为单纯房缺或室缺，心功能和营养发育良好，其母怀孕期间无维生素缺乏病史。在取标本期间未接受任何影响免疫功能的治疗，如放射，激素，及免疫抑制治疗等。
主要试剂 全反式视黄酸ａｔＲＡ购自Ｓｉｇｍａ公司。ＲＡＲα受体特异性拮抗剂Ｒｏ４１５２５３由Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ．Ｂａｓｌｅ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ公司惠赠，以上试剂均溶于ＤＭＳＯ中，配成１０ｍｍｏｌＬ储存液，置Ｎ２中－２０°Ｃ避光保存。用于流式细胞仪检测的荧光标记的抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８单抗均购自ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ公司。ＲＮＡ抽提与逆转录试剂购自ＧＩＢＣＯ公司。培养液：ＲＰＭＩ １６４０培养液含２ｍｍｏｌＬ谷氨酰胺购自 ＧＩＢＣＯ，含１５％ ５６℃灭活的小牛血清，１００Ｕｍｌ青霉素，１００μｇｍｌ链霉素，１ｍｍｏｌＬ丙酮酸钠。并按实验设计加入生理浓度的ａｔＲＡ １０６ｍｏｌＬ，Ｒｏ４１５２５３ １０５ ｍｏｌＬ４。
胸腺标本采集与细胞悬液的制备 将手术切除的部分胸腺立即置冷ＲＰＭＩ １６４０培养液中剪碎，采用Ｆｉｃｏｌｌ法分离胸腺细胞并制成细胞悬液，调成１×１０６·ｍｌ－１备用。采用台盼蓝摄入法检测细胞活力，至少９５％以上的细胞台盼蓝染色阴性。
胸腺组织培养 参照文献５，在直径为６ｃｍ的培养皿中放入明胶海绵，并在其上置孔径为０．８μｍ的微孔滤膜，并将大小约１ｍｍ３的胸腺组织置滤膜上。并按加入的培养液的不同分为空白对照组ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃ、视黄酸组ＲＡ、ＲＡ＋Ｒｏ４１－５２５３组ＡＯ组，置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中，各组均分别培养２４、４８、７２ｈ并在各时间点分离收集胸腺细胞，制成细胞悬液。
细胞表面标志分析 取胸腺细胞悬液１００μｌ，加荧光标记的抗ＣＤ４、ＣＤ８单克隆抗体染色后，并同时用荧光标记的抗ＣＤ３单克隆抗体染色作为分选指标，用流式细胞仪ＦＡＣＳｃａｎ ＢＤ公司分析结果。
总ＲＮＡ抽提及逆转录ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰＣＲ ＲＴ－ＰＣＲ 取各时间点胸腺细胞，采用 ＴＲＩｚｏｌ抽提总ＲＮＡ，操作按试剂盒说明进行。抽提的总ＲＮＡ用ＭＭＬＶＭｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉｎ ｖｉｒｕｓ，莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，将ＲＮＡ逆转录合成ｃＤＮＡ。采用阳性特异性扩增产物经回收纯化和测定ＯＤ２６０值准确定量后，１０的倍比稀释 １０６～１０１０拷贝数５０ｎｇ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ 制备标准曲线，加入ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅＲｏｃｈｅ荧光染料，进行实时定量ＰＣＲ扩增，每一样本的拷贝数采用ＡＢＩ７０００实时定量ＰＣＲ仪ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ提供的分析软件，将样本的Ｃｔ值与标准曲线比较而得到其拷贝数。视黄酸受体基因ＲＡＲα的引物采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５软件设计，由赛百盛生物技术公司合成，上游引物序列为５’ＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＧＡＣＣＧＡＡＡＣ３’下游引物序列为５’ＴＴＧＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＴＣ３’产物片段长度为２１１ｂｐ。
数据处理 应用ＳＰＳＳ统计软件进行处理。采用双因素方差分析，并进行相关分析。 以均数±标准差Ｘ±ｓ表示，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。
２ 结 果
视黄酸对胸腺细胞发育的影响 实验中所采用的溶剂是０．１％的ＤＭＳＯ，在预试验中，我们采用台盼蓝染色，观察了ＤＭＳＯ对胸腺细胞存活率的影响，结果表明，该浓度的ＤＭＳＯ与正常空白 对照组相比差异无显著性。这表明微量的ＤＭＳＯ对体外培养体系中的胸腺细胞发育无影响。
流式细胞仪的分析结果显示对照组胸腺细胞在体外胸腺组织培养条件下可逐渐发育成熟，主要表现为，ＣＤ４＋ＣＤ８＋的未成熟胸腺细胞在培养过程中逐渐下降，而ＣＤ８＋成熟胸腺细胞升高，以培养２４ｈ为显著。这表明体外胸腺组织培养体系能维持胸腺细胞的发育，胸腺细胞的发育须胸腺基质内环境的支持，体外培养条件下，胸腺基质细胞可能通过分泌细胞因子促进胸腺细胞成熟。
ＲＡ组ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞在培养２４ｈ并无明显下降，在培养４８ｈ后才开始下降图１，而ＣＤ８＋细胞虽有所增加，但仍低于对照组Ｐ＜０．０５加入ＲＡＲα受体特异性拮抗剂Ｒｏ４１５２５３在培养２４ｈ ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞即下降，与ＲＡ组差异有显著性Ｐ＜０．０５，提示ＲＡ阻抑ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ８＋细胞的分化，而该作用可被ＲＡＲα受体特异性拮抗剂抵销图２。
体外培养加入ＲＡ ２４ｈ，ＣＤ４＋胸腺细胞明显增加，与对照组相比差异显著Ｐ＜０．０５；这种作用在加入Ｒｏ４１５２５３后则与同时间点空白对照无差异图３。这表明ＲＡ促进ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ４＋细胞的分化。
２．２ 胸腺细胞体外培养过程中ＲＡＲα ｍＲＮＡ的表达变化 在体外培养过程中，对照组ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达逐渐下降，这种趋势与体外培养体系ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞的成熟分化呈正相关变化ｒ＝０．５９３，Ｐ＝０．０４２。加入ＲＡ后ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达在培养４８ｈ仍维持较高水平，与同一时间点对照组相比差异有显著性Ｐ＜０．０５；但与ＣＤ８＋胸腺细胞百分数成负相关ｒ＝－０．６５４，Ｐ＝０．０２１。加入Ｒｏ４１５２５３后ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达下降。
３ 讨论
视黄酸具有广泛的生物学效应，研究表明，视黄酸通过与视黄酸受体结合而发挥作用。视黄酸受体基因表达的多样性及复杂性是视黄酸介导广泛生物学效应的分子基础６。本研究证实，胸腺细胞在分化发育的各个阶段均表达ＲＡＲα ｍＲＮＡ。
我们结果表明，在体外培养的２４～４８ｈ，视黄酸能促进胸腺细胞向ＣＤ４＋胸腺细胞分化，这种作用在培养２４ｈ尤为明显；另一方面，ＲＡ显著抑制胸腺细胞向ＣＤ８＋胸腺细胞分化，这种变化与视黄酸对ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达的影响相一致，并且在加入ＲＡＲα特异性拮抗剂Ｒｏ４１５２５３后能抵消上述作用，这表明，ＲＡ是通过与ＲＡＲα结合而发挥调控胸腺细胞发育的作用。 既往研究认为７，ＲＡＲα主要在胸腺细胞发育的ＣＤ４＋ＣＤ８＋阶段表达，我们通过实时荧光定量ＰＣＲ法测定不同时间点ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达的变化，结果发现，体外培养过程中ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达逐渐下降，这与ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞的下降相一致，这提示ＣＤ４＋ＣＤ８＋细胞可能是ＲＡ作用的主要靶细胞。因此，我们认为，通过影响ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞ＲＡＲα ｍＲＮＡ的表达，可能对调节ＣＤ４＋ＣＤ８＋细胞的分化具有重要作用。
本研究还发现，加入ＲＡ后ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞与对照组相比显著升高，这表明ＲＡ能抑制ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞的分化成熟，但此时ＣＤ４－ＣＤ８－胸腺细胞并无明显变化，ＣＤ４＋胸腺细胞升高，故我们认为，这种作用主要是抑制了ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ８＋胸腺细胞分化。可见，ＲＡ一方面促进ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞向ＣＤ４＋胸腺细胞分化；另一方面，又抑制其向ＣＤ８＋胸腺细胞分化，ＲＡ对不同分化阶段胸腺细胞的作用的不同可能源于其ＲＡＲα ｍＲＮＡ表达的差异。
研究证实，ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞表达ＣＤ４及ＣＤ８协同受体分子，是一种未成熟的双向的前体细胞，具有向ＣＤ４＋ＣＤ８－或ＣＤ８＋ＣＤ４－单阳性成熟Ｔ细胞分化的能力，这主要取决于ＴＣＲＴ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｔ细胞受体的ＭＨＣｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，主要组织相容性复合物特异性， ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞表达ＭＨＣＩＩ类特异性ＴＣＲ则分化为ＣＤ４＋胸腺细胞，若表达ＭＨＣＩ类特异性ＴＣＲ则分化为ＣＤ８＋胸腺细胞８。Ｙａｇｉ等７研究发现ＲＡ显著抑制ＣＤ４－ＣＤ８－胸腺细胞及ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞的ＣＤ３及ＴＣＲ基因表达的上调，因此，我们推测，ＲＡ可能通过其受体途径影响ＴＣＲ、ＭＨＣ基因的表达从而影响Ｔ淋巴细胞发育。另一方面，有研究认为，胸腺早期发育过程中表达的一些细胞因子或某些蛋白可影响ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺细胞分化９１０。因此，ＲＡ是否通过其受体途径影响这些细胞因子或蛋白的表达，从而间接调控Ｔ细胞发育尚需进一步研究。
本研究主要观察ＲＡＲα途径的活化与阻抑对胸腺细胞成熟的作用。由于视黄酸受体尚有其它的亚型，研究表明，不同的视黄酸受体亚型具有不同的生理功能，胸腺细胞在发育过程中还表达ＲＡＲγ、ＲＸＲα等。Ｓｚｏｎｄｙ等１１认为ＲＡＲα的表达与活化能抑制胸腺细胞凋亡，而ＲＡＲγ途径则诱导胸腺细胞凋亡。该研究认为，生理浓度的全反式视黄酸ａｔＲＡ并不影响活化诱导的胸腺细胞凋亡，这是由于ＲＡＲα与ＲＡＲγ处于相对平衡，若增加ａｔＲＡ浓度，使其在体内转化为９顺式视黄酸，则激活ＲＸＲｓ，加强了ＲＡＲα的抑制作用，抵消ＲＡＲγ介导的促凋亡作用。这表明，通过精确调节ＲＡＲｓ表达，导致ＲＡＲαＲＡＲγ表达比值的变化可影响细胞的发育。因此，进一步对其它视黄酸受体的深入研究，有利于我们理解视黄酸调控胸腺细胞发育的确切机制。
总之，ＲＡ对胸腺细胞发育具有重要的调节作用， ＲＡＲα特异性拮抗剂Ｒｏ４１５２５３能拮抗这种作用，提示ＲＡ可能通过ＲＡＲα途径发挥调节胸腺细胞发育的作用。由于Ｔ细胞在细胞免疫以及活化辅助Ｂ细胞产生抗体的过程中均发挥重要作用，本研究显示，视黄酸受体α途径的活化在促进ＣＤ４＋细胞的发育中起重要作用，这为临床合理使用维生素Ａ制剂增强儿童免疫功能提供了理论依据。
参考文献：
１． Ｂｏｒｏｗｓｋｉ Ｃ Ｍａｒｔｉｎ Ｃ Ｇｏｕｎａｒｉ Ｆ ｅｔ ａｌ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂｒｉｎｋ ｏｆ ｂｅｃｏｍｉｎｇ ａ Ｔ ｃｅｌｌ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ １４２００－２０６．
２． Ｂｏｕｓｓｏ Ｐ Ｂｈａｋｔａ ＮＲ Ｌｅｗｉｓ ＲＳ ｅｔ ａｌ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＴｈｙｍｏｃｙｔｅＳｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ＴｗｏＰｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２ ２９６１８７６－１８７０．
３． Ｓｐｉｔｓ Ｈ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ αβ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｍｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ ２７６０－７７２．
４． Ａｐｆｅｌ ＣＭ Ｂａｕｅｒ Ｆ Ｃｒｅｔｔａｚ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ α ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １９９２ ８９７１２９－７１３３．
５． Ｍａｎｄｅｌ ＴＥ Ｋｅｎｎｅｄｙ ＭＭ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９７８ ３５３１７－３３１．
６． Ｃｈａｍｂｏｎ Ｐ． Ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９６ １０９４０－９５４．
７． Ｙａｇｉ Ｊ Ｕｃｈｉｄａ Ｔ Ｋｕｒｏｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ． Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ １８１１５３－１６２．
８． Ｇｅｒｍａｉｎ ＲＮ． Ｔｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ＣＤ４ＣＤ８ ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｃｉｓｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ ２３０９－３２２．
９． Ｂｒｕｇｎｅｒａ Ｅ Ｂｈａｎｄｏｏｌａ Ａ Ｃｉｂｏｔｔｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｖｅｒｓａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ ｓｉｇｎａｌｅｄ ＣＤ４＋８＋ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｔｅｒｍｉｎａｔｅ ＣＤ８ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｖｅｎ ｗｈｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０００ １３５９－７１
１０． Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＣ Ｒｏｂｅｙ ＥＡ Ｈｕａｎｇ ＹＨ． Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２００１ １１５５４－５６０．
１１． Ｓｚｏｎｄｙ Ｚ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕ Ｂｅｒｎａｒｄｏｎ ＪＭ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ａｌｌｔｒａｎｓ ａｎｄ ９ｃｉｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９８ ３３１７６７－７７４． | 