|
杨 红 杨 毅 王卫平 姚海丽(上海医科大学儿科医院儿保科及儿研所，上海 ２０００３２)
摘要：目的 研究视黄酸（ＲＡ）促进脐血淋巴细胞（ＣＢＬ）抗体生成的作用机制。方法 对脐血标本进行血清维生素Ａ（ＶＡ）浓度测定，采用ＲＴＰＣＲ法检测ＣＢＬ中视黄酸受体α（ＲＡＲα）的基因表达水平，并采用ＥＬ ＩＳＡ法检测细胞培养上清液中ＩｇＭ含量。结果 脐血血清ＶＡ水平与未培养ＣＢＬ中ＲＡＲα的基因表达水平之间存在正相关ｒ＝０．５０Ｐ＜０．０１；ＲＡ增加金黄色葡萄球菌Ｃｏｗ ａｎ Ｉ株（ＳＡＣ）活化ＣＢＬ的ＩｇＭ生成能力（Ｐ＜０．００１）；ＲＡ上调ＳＡＣ活化ＣＢＬ中ＲＡＲα的基因表达水平（Ｐ＜０．００１； ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩｇＭ生成的上调幅度之间存在正相关：ｒ＝０．０４Ｐ＜０．０５。结论 ＲＡ对ＣＢＬ抗体生成的促进作用可能通过ＲＡＲα途径传递。
关键词：视黄酸受体；基因表达；脐血淋巴细胞；抗体生成
Ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅｔｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ＹＡＮＧ Ｈｏｎｇ ＷＡＮＧ Ｗｅｉｐｉｎｇ ＹＡＮＧ Ｙｉ ＹＡＯ ＨａｉｌｉＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ＲＡｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓＣＢＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｉｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒαＲＡＲαｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ＩｇＭ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＥＬ ＩＳＡ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｒｕｍ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ＣＢＬ ｒ＝０．５０Ｐ＜０．０１． ＩｇＭ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＳＡＣａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＢＬ ｗａｓ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ＲＡＰ＜０．００１． ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＳＡＣａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＢＬ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ＲＡＰ＜０．００１． ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＳＡＣａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＢＬ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ＲＡＰ＜０．０１． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ＲＡＲα ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ｏｆ ＩｇＭ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ＲＡ ｒ＝０．４０Ｐ＜０．０５． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｏｕｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ＲＡＲα ｐａｔｈｗａｙ ｐｅｒｈａｐｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｍａｉｎ ｗａｙｓ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ＲＡ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＢＬ．
Ｋｅｙｗｏｒｄ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒα ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
近些年的研究已证实维生素Ａ（ＶＡ）对免疫系统，对Ｔ、Ｂ淋巴细胞功能具有调节作用１。ＶＡ的主要活性产物——视黄酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ，ＲＡ）能促进体外培养的脐血单个核细胞产生免疫球蛋白２，但其作用途径和机制有待进一步阐明。为此，我们测定了脐血血清ＶＡ水平，并采用逆转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴＰＣＲ）技术，检测分析ＲＡ对脐血淋巴细胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍ ｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＣＢＬ）中视黄酸受体α（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒα，ＲＡＲα）基因表达水平的调节，以探讨ＲＡ对脐血淋巴细胞抗体生成能力的促进作用是否通过ＲＡＲα调节的途径。
１ 材料与方法
１．１ 脐血血清ＶＡ测定
脐血获自上海市金山区金卫乡卫生院母婴健康且营养状态良好的顺产儿，本研究参考刘继鹏等的方法，采用微量荧光分光光度法测定脐血血清ＶＡ浓度。
１．２ 淋巴细胞体外培养
脐血分离单个核细胞后，用含１５％小牛血清ＧＢＣＯ产品的ＲＰＭＩ１６４０培养液ＧＢＣＯ产品悬浮细胞为１０６ｍＬ，培养在９６孔Ｕ型板中，加入ＳＡＣ（ＣＡＬＢＤＣＨＥＭ产品），浓度为１∶１ ８００；视黄酸（ＲＡ，Ｓｉｇｍａ公司产品）浓度１×１０６ｍｏｌＬ，在培养２４ｈ后收获细胞，留置未培养的单个核细胞作为对照。培养７ｄ后收集细胞上清液进行ＩｇＭ含量测定。
１．３ ＲＴＰＣＲ检测ＲＡＲαｍＲＮＡ
１．３．１ 总ＲＮＡ抽提：培养前后的脐血淋巴细胞采用ＴＲ Ｉｚｏ１试剂（ＧＢＣＯ产品）提取制备总ＲＮＡ，用紫外分光光度计（日本岛津ＵＶ１６０１）测定波长为２６０ｎｍ时的ＯＤ值进行准确定量。
１．３．２ 引物设计：参考国外文献资料并采用计算机辅助设计，ＲＡＲα的上下游引物分别为５’ＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＣ３’和５’ＧＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣ３’。引物由中国科学院上海生物化学研究所合成。
１．３．３ ＲＴＰＣＲ：取１μｇ总ＲＮＡ经ＭＭＬＶ逆转录酶（ＧＢＣＯ产品）催化合成ｃＤＮＡ第一链，并以此为模板进行ＰＣＲ扩增，取扩增产物１０μｌ走２％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果并照相（英国）ＵＶＰ公司紫外凝胶成像及分析仪）。
１．４ 细胞上清液中ＩｇＭ含量的测定
采用ＥＬ ＩＳＡ双抗夹心法检测上清液中ＩｇＭ含量。
１．５ 结果分析与显著性检验
采用紫外凝胶成像及分析系统英国ＵＶＰ公司对电泳凝胶中的ＰＣＲ产物条带进行定量分配对资料比较的显著性检验采用配对ｒ检验直线相关系数的显著性检验根据ｒ 值直接查ｒ 界值表。
２ 结果
２．１ 脐血血清ＶＡ水平及其与ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表达水平的相关性
脐血血清ＶＡ水平的平均值为１．０６±０．３５μｍｏｌＬ。对脐血血清ＶＡ水平与未培养ＣＢＬ中ＲＡＲα的基因表达水平之间作相关分析发现，两者之间存在显著正相关ｒ＝０．５０，Ｐ＜０．０１图１。
２．２ ＲＡ对体外培养ＣＢＬ的ＩｇＭ生成能力的促进作用
ＲＡ１×１０６ｍｏｌＬ增加ＳＡＣ刺激的ＣＢＬ的ＩｇＭ生成能力，由０．４４±０．３６ｍｇＬＳＡＣ刺激增加到１．２０±０．７２ｍｇＬＳＡＣ＋ＲＡ共同培养ｒ＝６．０９６ Ｐ＜０．００１，图２）。
２．３ ＲＡ对体外培养的ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表达的调节
ＣＢＬ在单纯ＳＡＣ刺激培养２４ｈ后，ＲＡＲαｍＲＮＡ水平为未培养时的１．２１±０．１８倍，加入ＲＡ与ＳＡＣ共同培养２４ｈ后，ＣＢＬ中ＲＡＲα的ｍＲＮＡ水平增加至未培养时的１．４５±０．２２倍，ＲＡ对ＲＡＲαｍＲＮＡ水平的上调具有显著性意义ｒ＝６．０２５，Ｐ＜０．００１，图３。
２．４ ＣＢＬ中ＲＡＲα基因表达水平与ＩｇＭ合成水平受ＲＡ上调幅度之间的相关性
ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩｇＭ生成的上调幅度间存在正相关关系：ｒ＝０．４０，Ｐ＜０．０１图４。
３ 讨论
自ＶＡ被发现以来，人们就观察到ＶＡ具有抗感染作用。Ｓｃｒｉｎｓｈａｗ指出“与ＶＡ缺乏相比，没有一种其他营养素的缺乏与感染性疾病之间具有更密切的相关关系”４。ＶＡ通过其免疫调节作用而发挥抗感染作用。类ＶＡ对Ｔ、Ｂ淋巴细胞的活化、增殖及分化具有重要的调节功能１。本研究表明类ＶＡ的代表分子——ＲＡ能够促进体外培养的ＣＢＬ的ＩｇＭ生成能力，但其作用途径和机制需进一步阐明。
１９８７年视黄酸受体（ＲＡＲｓ）的发现５，大大促进并深化了对ＶＡ增强免疫功能的机制研究。ＲＡＲｓ属于类固醇甲状腺激素核内受体超家族成员，包括３种亚型：ＲＡＲα、ＲＡＲβ及 ＲＡＲγ６。近年来，我们观ＲＡＲα基因的转录表达受丝裂原和ＲＡ调节。
本研究观察到脐血血清ＶＡ水平越高，ＲＡＲα的表达水平也越高，两者之间存在显著正相关。
本研究表明ＲＡ能够上调ＳＡＣ活化ＣＢＬ中ＲＡＲα的基因表达，并且ＲＡ使ＲＡＲα基因表达的上调幅度与ＲＡ使ＩｇＭ生成的上调幅度之间存在正相关关系，提示ＲＡ对ＣＢＬ的ＩｇＭ生成的促进作用可能通过ＲＡＲα途径传递。
参考文献：
１． Ｓｅｍｂａ ＲＤ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ ｉｎ ｉｎｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎｕｔｒ Ｒ ｅｖ １９９８ ５６１∶ｓ３８－ｓ４８．
２． Ｗａｎｇ Ｗ Ｂａｌｌｏｗ Ｍ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９３ １４８∶２９１－３００．
３． 刘继鹏奚金宝阎志等．血清维生素Ａ微量荧光测定法的改进和应用． 营养学报 １９８５ ７∶１３６－１４０．
４． Ｓｃｒｉｎｓｈａｗ ＮＳ Ｔａｙｌｏｒ ＣＥ Ｇｏｒｄｏｎ ＪＥ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎＡ． Ｇｅｎｅｖａ∶ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ１９６８．
５． Ｍａｒｔｉｎ Ｐ Ｎｉｇｅｌ Ｂ Ａｎｄｒｅｅ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｎａｔｕｒｅ １９８７ ３３０∶４４４－４５０．
６． Ｙｕｉｃｈｉ Ｈａｓｈｉｎｏｔｏ． Ｒｅｔｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ １９９１１６∶１１３－１２３．
７． 王卫平 杨毅 苏贻新． 人外周血淋巴细胞视黄酸受体基因的表达与调控． 营养学报 １９９８ ２０∶２７５－２８０． | 