单延春 盛晓阳 洪昭毅 薛敏波（上海第二医科大学附属新华医院儿保科，上海 200092） 锌对免疫系统的发育和正常免疫功能的维持有着不可忽视的作用（1）。锌缺乏导致机体免疫功能降低，补充锌剂可增强机体抵抗力，但是锌通过何种机制影响机体免疫功能尚需进一步探讨。近年来一系列研究发现，在体外培养细胞中，高浓度的锌可抑制凋亡，而用络合剂去除锌则有促进细胞凋亡的作用(2,3)。胸腺是中枢免疫器官，是T淋巴细胞分化成熟的场所；脾脏是外周免疫器官，是T、B淋巴细胞进行免疫应答的场所。研究锌缺乏对胸腺、脾脏淋巴细胞凋亡的影响，对于阐明锌影响机体免疫功能的机制有重要意义。本文通过控制饮食建立生长期缺锌大鼠模型，从活体观点研究锌缺乏对胸腺、脾脏淋巴细胞凋亡的影响，为临床应用锌剂作为免疫辅助剂提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组
采用中科院上海动物所提供的刚断奶的雄性SD大鼠30只，按体重配对分为3组，缺锌组10只，配饲组10只，正常对照组10只。
1.2 动物模型的建立
饲料配方：样品采用灰化法经原子吸收分光光度仪测定。
(1)正常锌饲料：参照美国营养协会推荐的AIN-76配方（4）配制成的半合成饲料，含锌量30mg/kg。
(2)在正常配方的无机盐中去除锌盐，配成缺锌饲料。含锌量＜1mg/kg。
饲养方法：动物房洁净无尘，室温控制在24℃左右，湿度50%，光照及黑夜由人工控制，各12小时。在不锈钢笼具内单笼饲养，定期用双蒸水冲洗。缺锌组自由食用缺锌饲料；正常对照组自由食用正常饲料；配饲组食用正常饲料，但进食量控制为缺锌组大鼠前一天进食量。各组大鼠自由饮用去离于水。 于第11天处死大鼠取血和胸腺、脾脏进行各项指标检测。
1.3 检测指标及方法
微量元素锌的测定 使用Perkin-Elmer公司 4100型原子吸收分光光度仪火焰法测饲料和血 清锌。
胸腺、脾脏的组织学观察 大鼠处死后迅速去胸腺、脾脏，置与于4％多聚甲醛磷酸缓冲液中固定，常规制作石蜡切片，HE染色后普通光镜下观察。
胸腺、脾脏组织细胞原位凋亡的测定 采用TUNEL方法（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick ended-labeling method），严格按照试剂盒说明操作，DAB显色，二甲苯透明、封片后，显微镜下观察结果。每张切片高倍视野下随机取六个视野，用德国西门子公司KS4000型图像分析系统进行阳性率和强阳性率的分析。
1.4 统计分析
采用STATISTICA统计软件进行分析。
基金项目：香港中文大学资助课题。
2 结 果
2.1 缺锌饲料对生长期大鼠一般情况和血清锌的影响
缺锌组大鼠于缺锌饲料喂养3～4天出现食欲不振，继而出现腹泻、生长迟缓、皮炎等缺锌症状。该组大鼠于实验第4～5天起体重明显落后于对照组和配饲组，处死前三组大鼠体重及其增长速度有显著差异，三组大鼠的饲料效价（总增重/总饲料消耗）也有明显差异（表1）。 缺锌组大鼠血清锌浓度显著低于配饲组和对照组。
表1 锌对大鼠体重增长和饲料效价的影响
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组别 |
例 |
初重（ g ） |
终重（ g ） |
增长值（ g ） |
饲料效价 (g/g) |
血清锌 ( μ mol/L) |
|
缺锌组 |
10 |
50.1 ± 2.51 |
60.8 ± 4.32 a ,b |
10.6 ± 2.12 a ,b |
0.164 ± 0.022 a ,b |
10.60 ± 1.847 a ,b |
|
配饲组 |
10 |
50.1 ± 2.60 |
74.9 ± 3.57 a |
24.8 ± 1.99 a |
0.387 ± 0.038 c |
20.46 ± 3.892 |
|
对照组 |
10 |
50.2 ± 3.33 |
100.7 ± 5.62 |
50.5 ± 3.66 |
0.336 ± 0.016 |
21.50 ± 3.559 |
2.2 锌对胸腺、脾脏重量，胸腺、脾脏指数的影响
缺锌组大鼠胸腺与对照组和配饲组相比有明显萎缩，脾脏体积和重量也明显低于对照组和配饲组（表2）。
表2 饲料锌对胸腺、脾脏重量的影响
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组别 |
例数 |
胸腺重（ g ） |
胸腺指数 |
脾脏重（ g ） |
脾脏指数 |
|
缺锌组 |
10 |
0.0997 ± 0.0062 a ,b |
1.643 ± 0.089 a ,b |
0.1330 ± 0.0104 a ,b |
2.189 ± 0.114 a ,b |
|
对照组 |
10 |
0.4042 ± 0.0123 |
4.020 ± 0.139 |
0.5022 ± 0.0169 |
4.993 ± 0.141 |
|
配饲组 |
10 |
0.3078 ± 0.0108 a |
4.113 ± 0.109 |
0.3692 ± 0.0170 a |
4.931 ± 0.111 |
2.3 胸腺、脾脏的病理观察
胸腺：缺锌组大鼠胸腺明显萎缩，皮质变薄、疏松，淋巴细胞数量明显减少，皮髓质分界模糊，皮质内可见体积缩小、核固缩的细胞，胸腺小体数量也明显减少（图1、2）。 配饲组与对照组无明显差异。
脾脏：缺锌组大鼠脾脏白髓数量和体积均明显减少，淋巴细胞数量也明显减少，动脉周围淋巴鞘变薄（图3、4）。 配饲组与对照组无明显差异。
图 1 ：缺锌大鼠胸腺 *40
图 2 ：对照大鼠胸腺 *40
图 3 ：缺锌大鼠脾脏 *40
图 4 ：对照大鼠脾脏 *40
图 5 ： TUNEL 检测缺锌大鼠胸腺 *400
图 6 ： TUNEL 检测对照大鼠胸腺 *400
图 7 ： TUNEL 检测缺锌大鼠脾脏 *400
图 8 ： TUNEL 检测对照大鼠脾脏 *400
2.4 胸腺、脾脏淋巴细胞末端标记原位凋亡的测定
用TUNEL方法对三组大鼠的胸腺和脾脏进行原位凋亡的测定，阳性细胞染成棕黄色。结果显示：缺锌组大鼠胸腺皮质和脾脏白髓中的凋亡细胞明显多于对照组和配饲组（图5-8）。图像分析结果显示：缺锌组大鼠胸腺细胞阳性率和强阳性率明显高于配饲组和对照组，脾脏白髓内淋巴细胞阳性率和强阳性率也明显高于配饲组和对照组；配饲组除胸腺细胞阳性率高于对照组外，其余与对照组无差别（表3）。
表3 饲料对大鼠胸腺、脾脏淋巴细胞凋亡的影响 %
|
组别
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例数
（ n ） |
胸腺
阳性率 |
强阳性率 |
脾脏
阳性率 |
强阳性率 |
|
缺锌组 |
10 |
11.88 ± 3.10 a ,b |
3.81 ± 1.31 a ,b |
19.31 ± 3.63 a ,b |
6.91 ± 2.02 a ,b |
|
配饲组 |
10 |
5.90 ± 2.92 c |
1.31 ± 0.71 d |
1.02 ± 1.02 d |
0.14 ± 0.10 d |
|
对照组 |
10 |
1.68 ± 0.71 |
0.60 ± 0.24 |
3.54 ± 2.80 |
0.45 ± 0.31 |
讨 论
锌以锌离子、锌依赖酶或其它锌蛋白的形式存在于体内，具有广泛的生理功能。其中，锌对免疫系统的发育和正常免疫功能的维持有着不可忽视的作用。尤其在儿科临床中，锌剂用以预防和辅助治疗儿童感染性疾病更值得引起重视（5，6）。儿童期的免疫系统处在快速发育但功能尚不成熟的阶段，无论在结构还是功能上都有自己的特点，与成人有显著差异。本研究采用生长期大鼠构建缺锌动物模型，目的是更好地代表儿童期免疫系统的特点。
本实验模型采用半合成饲料，人为控制锌摄入量。结果发现缺锌组大鼠从第3～4天开始出现食欲不振，继而出现腹泻、生长迟缓、皮炎等，饲料效价明显降低，血清锌浓度明显低于配饲组和对照组。表明复制的缺锌大鼠模型是成功的。研究发现缺锌组大鼠胸腺、脾脏重量，胸腺、脾脏指数均显著低于对照组和配饲组，提示缺锌特异性抑制了免疫器官发育，导致胸腺、脾脏萎缩，与文献报道一致（7）。病理结果发现，缺锌时胸腺皮质明显变薄，淋巴细胞减少， 脾脏白髓数量和体积均减少，这可解释锌缺乏时机体的免疫功能降低的原因。 那么，锌缺乏是通过何种机制使得免疫器官发生如此改变呢？
近年来一系列研究发现，在体外培养细胞中，高浓度的锌可抑制凋亡，而 用络合剂去除锌则有促进凋亡的作用，但尚未看到活体实验的报道。细胞凋亡 是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程，以凋亡小体形成、染色体DNA断裂、胞膜及核膜皱缩为特征。在免疫系统的发育和功能行使过程中，细胞凋亡始终扮演重 要角色，淋巴细胞的分化、成熟乃至死亡过程都伴随着凋亡（8）。胸腺是T细胞发育成熟的场所，来自骨髓的T细胞必须经过阳性及阴性选择，才能发育成熟。 胸腺内的选择过程导致95％以上的胸腺细胞死亡，其主要的死亡方式是凋亡。 1992年Gavrid等首先提出利用TdT介导的DNA缺口末端标记技术可原位检测细胞核的DNA断裂从而识别凋亡细胞（9）。本实验用TUNEL方法研究表明，缺锌组大鼠胸腺皮质和脾脏白髓中的凋亡细胞明显多于对照组和配饲组。说明锌缺乏导致发育中的和成熟的淋巴细胞凋亡增多，这可能是缺锌时胸腺萎缩、淋巴细胞数量减少，机体免疫力低下的主要机制之一。这一结果与体外细胞培养实验结果一致（3）。
本实验结果提示，生长期锌缺乏大鼠胸腺、脾脏萎缩，胸腺细胞和脾脏淋巴细胞凋亡增多，导致免疫活性细胞减少，可能是其机体免疫力下降的机制之一。
4 参 考 文 献
1. Fraker P. J, King LE, Laakko T, et al. The dynamic link between the integrity of the immune system and zinc status. J. Nutr 2000, 130 (5s) Suppl: 1399s-1406s.
2. Cohen J and Duke R. Apoptosis and programmed ce11 death in immunity.Annu. Rev. Immuno1. 1992 10:267-304.
3. Treves S, Trentini PL, Ascanelli M,et a1. Apoptosis is dependent on intracel1u1ar zinc and independent of intrace11u1ar calcium in 1ymphocytes. Exp Ce11 Res. 1994; 211: 339-343.
4. Ad Hoc Committee on standards for nutritiona1 studies:report of the American Institute of Nutrition. J nutr, 1977, 107(1):1340.
5. Robert EB. Therapeutic and preventive effects of zinc on serious chi1dhood infectious diseases in deve1oping countries. Am J C1in Nutr.l998, 68 (supp1): 476s--479s.
6. Suni1 S, Robert EB, San ju J, et a1. Zinc supp1ementation reduces incidence of acute 1ower respiratory infections in infants and preschoo1 chi1dren: a doub1e b1ind, contro11ed tria1. Pediatrics. 1998;102:1-5.
7. 徐迪雄、吴嘉惠等.锌对大鼠胸腺、脾脏淋巴细胞增殖功能影响的研究.第三军医大学学报.1995, 17 (4):322--325.
8. 龚非力主编.医学免疫学.第一版.北京：科学出版社.2000: 267--269.
9. Gavriel Y, et a1. Identification of programmed ce11 death in situ via specific 1abe1ing of nuclear DNA fragmentation. J Ce11 Bio1. 1992; 119: 493.
The effect of zinc deficiency on apoptosis of immunocytes in growing rats.
Shan yanchun, sheng xiaoyang, hong zhaoyi,et al.(Department of Child Health Care,Xinhua Hospital,Shanghai Second Medical University. Shanghai,200092)
Abstract: [Objective] To observe the effect of dietary zinc deficiency on thymocytes and spleen 1ymphocytes, and its re1ationship to apoptosis in growing rats. [Methods] After deve1oping a zinc-deficient rat mode1, using TUNEL(termina1 deoxynucleotidy1 transferase-mediated dUTP nick endlabe1ing)method, the apoptosis of thymocytes and sp1een 1ymphocytes was checked. [Resu1ts] The cortex of thymus and white pu1p of sp1een were appeared atrophy in zinc deficient group. The percentage of apoptosis in the thymus and white pulp of sp1een were higer in zinc deficient group than in contro1 group and paired-fed group. (P<0.01). [Conc1usion] Dietary zinc deficiency 1eads to increased apoptosis of 1ymDhocvtes. which ma\r he one of the poptos is of 1ymphocytes, which may be one of the important mechanisms of decreased immune function.
Keywords: Zinc Immunocytes Apoptosis
