程义勇 洪燕 耿战辉 李树田 王冬兰 天津卫生学环境医学研究所，天津 300050 随着社会经济的发展，人们在工作和生活中所承受的负荷及应激程度日益加大。近年研究资料证实，现代社会居民由于心理应激造成的心身危害，是多种退行性疾病发生和发展的重要诱发因素。高血压、糖尿病、冠心病、肿瘤等严重危害人类健康的疾病，都与心理应激密切相关〔1〕。如何解决这些问题将是现代预防医学面临的重要任务之一。
关于缺锌影响心理和行为的问题已经受到许多人的关注，但大多数研究报告涉及学习记忆方面的内容，即认知行为的改变〔2〕；而对于实验动物或人体缺锌时情绪行为方面的变化报道较少。本研究通过建立大鼠缺锌及心理应激动物模型，运用旷场实验观察应激引起的实验大鼠行为异常；在此基础上观察补锌对应激损伤的防护作用，并从海马神经细胞钙、钙调素以及金属硫蛋白的基因表达等方面探讨有关的中枢神经机制，为合理补充锌营养以提高机体应激适应能力提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 动物分组与饲养
用本所动物中心提供的110±20g雄性Wistar大鼠42只，按体重随机分为6组：缺锌组（ZD）、缺锌应激组（ZD-S），对喂组（PF）、对喂应激组（PF-S），对照组（AL）、对照应激组（AL-S）。其中缺锌、对照组的饲料Zn含量分别为3.7和41.6mg/kg。PF组喂饲对照饲料，但摄入量与ZD组一致。每天记录ZD（ZD-S）组摄食量，作为次日PF（PF-S）组的给料量；ZD（ZD-S）组及对照组均自由摄食。所用不锈钢笼具及玻璃饲料罐均经 EDTA浸泡24小时后去离子水浸泡冲洗。实验期间，ZD（ZD-S）组给予去离子水。缺锌喂养时间为3周。
1．2 缺锌饲料配制
参照Avery等〔3〕的资料略有改动，其中的饲料蛋白使用脱锌处理的大豆蛋白。
1．3 动物心理应激模型 实验进行两周后，各应激组大鼠接受光-电刺激，光-光周期为50秒，光-电刺 激间隔为10秒，之后40秒内不定期出现一次光。刺激参数为：⑴ 光：刺激光强度为35-40Lux，持续1秒，灯灭时实验盒内光强度约为2 Lux；⑵ 电：电流强度为1mA，持续1秒。每只大鼠实验时间为30分钟，连续6天后，各组大鼠进行行为学测定。
1．4 行为测定
以旷场实验测定实验动物的行为改变。实验时将大鼠置于旷场中间格，观察记录其自主活动情况。
1．5 海马脑区MT-1 mRNA表达水平检测（RT-PCR实验方法） 海马组织样品用异硫氰酸胍一步法提取总mRNA，逆转录为cDNA，以?-actin为内标准参照物，导入а-32P- dATP /dCTP，MT-1引物由上海生工生物工程公司合成。
PCR扩增条件：94oC预变性, 72 oC延伸，57 oC退火,反复进行30周期。
产物定量：取PCR扩增产物，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压120V，16h。放射自显影48h，光密度计扫描，以MT-1/?-actin吸收峰比值表示MT-1相对表达量。
1．6 海马细胞[Ca2+]i测定
参照Dildy的方法制备海马细胞悬液〔4〕 ，进行Fura-2/AM负载，用荧光法测定。
1．7 活性CaM测定
参照刘淑红等〔5〕的方法进行。
1．8 统计方法
组间进行t检验, 结果用?X±s 表示。
2．实验结果
2．1 实验大鼠的旷场行为表现（见表1）
表 1． 实验大鼠的旷场行为 (?X±s)
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中央格
分组 停留时间（ S ） 穿行格数 直立次数 修饰次数 |
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AL 16.4 ± 7 .7 21.6 ± 10 .3 7 .2 ± 1 .9 6 . 0 ± 4 . 1
AL-S 28.6 ± 16 .4 24 .2 ± 12 .5 5 .6 ± 2 .7 a 0 . 8 ± 1 . 6 b
ZD 25.4 ± 11 .3 8 .7 ± 3 .4 a 5 .1 ± 2 .2 a 1 . 0 ± 1 . 3 a
ZD-S 31.4 ± 16 .0 a 7 .0 ± 2 .3 a 4 .4 ± 1 .5 a 0 . 9 ± 1 . 4 a
PF 30.4 ± 9 .2 b 35 . 7 ± 11 . 3 a 19 .5 ± 6 . 2 b 2 . 7 ± 1 . 2 a
PF-S 39.8 ± 20 .4 a 30 .2 ± 16 .2 13 .8 ± 2 .5 b 0 . 1 ± 0 . 3 b
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2．2 实验大鼠海马细胞[Ca2+]i及活性CaM水平变化(见表2）
表2． [Ca2+]i及活性CaM水平变化情况(?X±s )
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Group [Ca 2+ ]i (nmol/L) CaM 荧光强度 |
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AL 172.9 ± 14.5 15.6 ± 1.87
AL-S 257.1 ± 68.0 13.4 ± 1.57
ZD 199.3 ± 12.6 a 11.8 ± 1.52 a
ZD-S 283.8 ± 32.1 a 15.0 ± 0.95
PF 180.6 ± 20.5 13.4 ± 1.79 a
PF-S 335.1 ± 57.1 a 13.8 ± 1.07 a
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2．3 大鼠海马脑区的MT-1 mRNA表达水平
验结果表明（表3），缺锌组大鼠海马脑区MTⅠ的相对表达量明显低于对喂组和对照组；应激对照组海马脑区MTⅠ的相对表达量明显高于对照组，应激对喂组较对喂组也有增高的趋势，而应激缺锌组大鼠海马脑区MTⅠ的相对表达量低于缺锌组。
表3 心理应激对大鼠海马MT-1 mRNA的影响 (?X±s,n=4)
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Group |
MT-1/ ? -action |
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ZD
ZD-S
PF
PF-S
AL
AL-S |
1.173 a b
0.668
2.143
3.255
2.560
4.408 b |
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3．讨论
本实验采用一种较纯粹的心理应激模型，即以灯光和电击分别作为条件和非条件刺激建立条件反射，再次单独给予电击时，动物会条件反射性地产生紧张和恐惧，此时躯体刺激成分已经很小,主要是心理应激成分的作用。结果发现：这种心理应激使各组动物的水平和垂直运动以及修饰次数减少，并且均以缺锌应激组最为明显，因此有理由认为缺锌加重了心理应激对动物行为的影响。
近期Takeda〔6〕和Itoh 等作者〔7〕发现，当实验大鼠喂饲缺锌饲料时其海马锌浓度明显降低，而其他脑区未见显著变化；同时，海马突触体锌浓度也明显低于对照，表明海马是中枢神经系统对锌缺乏敏感的区域。
由本研究的测定结果可以看到，缺锌可引起海马细胞[Ca2+]i升高而活性CaM水平降低。由于海马在情绪和行为的调节过程中起着非常重要的作用，这就提示动物缺锌导致的行为异常可能与其引起海马细胞[Ca2+]i 及其相关蛋白的变化有关。关于神经元静息[Ca2+]i 增加，Franklin等〔8〕曾提出神经元生存的Ca2+调定点假说（set-points hypothesis）。他认为在机体处于某种“不利”状态(如衰老、慢性疾病等)下，[Ca2+]i会在一定范围内波动(通常是升高)，但当[Ca2+]i大于调定点的高限或小于调定点的低限时，都会引起神经元功能紊乱甚至死亡。因此我们推测，本实验中ZD组海马细胞[Ca2+]i的升高可能是机体在缺锌这种不利条件下的生存适应反应；PF组大鼠因长期得不到充足食物而处于饥饿这种不利状态，可能是其海马细胞[Ca2+]i增高的原因；而活性CaM水平下降可能正是由于[Ca2+]i升高使CaM向结合型转化而引起的，也可能是缺锌时CaM激活相关酶使其消耗增加所致。
金属硫蛋白(MTs)是一组富含金属(如锌、镉等)和半胱氨酸的低分子量蛋白质。有关的研究表明，MTs在结合和释放金属离子，维护锌铜离子的平衡，保护细胞免于氧化反应，清除重金属等方面具有重要作用。尽管MT的发现迄今已有40余年，但有关脑内MTs的研究起步较晚。近年研究发现中枢神经系统(CNS)中也含有丰富的MTs，哺乳类动物脑内表达三种MT，即MTⅠ、Ⅱ和Ⅲ。溶液杂交法发现小鼠脑内三种MT的表达量为MTⅠ>MTⅢ>MTⅡ, MTⅢ和MTⅡmRNA的量分别为MTⅠ的70%和50%。MT是一类重要的应激反应蛋白，可通过清除自由基对抗应激过程中的抗氧化损伤。本研究发现缺锌可抑制海马脑区MTⅠ的表达，结果减少了心理应激诱导的MTⅠ合成，不利于机体应激适应能力的发挥。这可能是缺锌加重心理应激损伤的机制之一。
总之，本研究的资料表明了机体缺锌状况可能加重心理应激引起的行为异常，这些行为异常与海马脑区的功能改变密切相关。海马神经细胞钙浓度和钙调素水平的变化，以及海马脑区MT基因表达的异常，可能是缺锌导致应激动物适应能力下降的重要机制。
4、参考文献
1．程义勇：心理应激研究进展。医药卫生科学技术进展， 北京 1996。
2．耿占辉：锌营养与脑功能及行为的关系研究—历史和现状。国外医学 医学地理分册2001，
22（3）：97
3． Avery RA，Bettger WJ． Effects of dietary zinc deficiency and the associated drop
in voluntary food intake on rat erythrocyte membrane polyamines． J Nutr，1988，
118(8)：987-994．
4．Dildy JE，Leslie SW． Ethanol inhibit NMDA-induced increase in free intra-
-cellular Ca2+ in dissociated brain cells．Brain Res，1989，499(3)：383-387．
5． 刘淑红，范明，甘思德．细胞内钙调素相对活性荧光测量方法的改进．军事医学科学院院刊，1996，20(4)：316-317．
6. Atsushi Takeda，Sachiyo Takefuta，Shoji Okade，et al． Relationship between brain zinc and transient learning impairment of adult rats fed zinc-deficient diet．Brain Res，2000，859：352-357．
7. Itoh T，Saito T． Effect of zinc deficiency on the response of immobilization stress for the adult rat．Trace Elements and Electrolytes，2000，17(2)：76-81．
8. Franklin JL,Fickbohm DJ,Willard AL. Long- term regulation of neuronal calcium
currents by prolonged changes of membrane potential.J Neurosci, 1992, 12(5):1726-1735.
The Preventive Effects of Zinc on Behavior Changes in Rats under Psychological Stress
Cheng Yiyong, Hong Yan, Geng Zhanhui, Li Shutian, Wang Donglan
Tianjin Institute of Health and Environmental Medicine, Tianjin, 300050
The present study is to observe the rat behavior changes induced by psychological Stress, the preventive effects of zinc on the behavioral abnormality as well as the mechanisms involved. The rats were randomly divided into 6 groups: zinc deficiency(ZD), pair-fed(PF), control(AL) and their corresponding groups of stress rats(ZD-S, PF-S, AL-S). The psychological stress model was established by giving the animals light-electric stimulus. The behavior changes were tested in an open field equipment. The experimental results indicated that abnormal behaviors were observed in the rats sustained psychological stress and zinc deficiency made these changes more seriously. It was shown from the present study that the stress-induced behavior abnormality and the preventive effects of zinc on these changes were involved in the levels of calcium and calmodulin of neuron cell in hippocampus, as well as the zinc regulation of metallothionein-1 expression in this brain domain.
