韩军花 杨月欣 门建华 王竹（中国疾病预防控制中心营养与食品安全所， 北京 100050） 锌作为人体重要的必需微量元素，对维持细胞膜的结构和功能必不可少[1]。离子转运是细胞膜的重要功能，研究认为，对维持红细胞膜两侧的离子平衡起重要作用的K+、 Na+离子转运系统主要有Na+/K+泵、Na+/K+/Cl-联合转运系统（COTS-1）、Gardos通道（Gardos channel）、K+/Cl- 联合转运系统（COTS-2）以及残余渗漏（residual channel RF）等[2]。目前国内外关于锌与细胞膜转运关系的研究，多限于锌对Na+，K+-ATP酶和Ca2+，Mg2+-ATP酶活性的影响，而关于锌与红细胞膜上COTS-1、COTS-2、Gardos通道和RF等转运系统的关系尚未见报道。本研究从体内和体外两方面观察锌对红细胞膜Na+/K+泵、COTS-1、COTS-2、Gardos通道及RF等离子转运通道的影响，为进一步解释锌的作用机制提供依据。
1 材 料 与 方 法
1.1 主要生化试剂
ATP-Na2 ，丁苯氧酸（Bumetanide），MOPS等为Sigma 公司产品，乌苯苷 E Mark
公司产品，其余试剂均为国产优级纯或分析纯。各种试剂均用去离子水配制，所用容器均按微量元素实验室常规进行处理，在实验过程中严格避免各种污染。
1.2 动物饲料
采用美国AIN-76配方并进行适当调整，实测低、正常和高锌饲料中锌含量分别为2.2、28和128mg/kg。
1.3 动物分组及饲养
选用健康雄性Wistar断乳鼠30只，平均体重34.37g。按体重将动物随机分为低锌（LZ）、正常锌（NZ）和高锌（HZ）三组，每组10只，分别喂饲低、中、高锌饲料。动物用不锈钢代谢笼单笼饲养，自由饮去离子水。4周后， 低锌动物出现明显的进食量减少、体重增长缓慢、易激惹等体征后由腹主动脉取血进行各通道活性的测定。
1.4 体外实验
提取新鲜的健康成年人红细胞，加入不同浓度的锌溶液（0，5，10，50，100和500μmol/L Zn2+）进行温浴，测定各浓度下5种离子转运通道的活性。
1.5 Na+/K+泵、COTS-1、COTS-2的测定方法
按照Shoeat等[3] 的方法进行。新鲜血离心提取红细胞，将红细胞用冰冷的Na+/K+泵洗液洗涤3次，每次5min，调整红细胞悬液浓度为50% Hct左右，各反应管中加入不同的离子后，Na+/K+泵测定管加入1.2mmol/L乌苯苷，COTS-1测定管中加入1.2mmol/L丁苯氧酸，COTS-2测定管中加入12mmol/L丁苯氧酸，并设对照管。各管均加入50% Hct红细胞0.1ml，加样后轻轻混匀，置37℃水浴60min，迅速加入冰冷的Na+/K+泵反应终止液，每管0.6ml，离心洗涤三次，每次5min；最后每管加入15%三氯乙酸0.6ml，振荡混合后静置消化8~10h，离心，吸取上清并稀释10倍后原子发射法测定各个样品管中的Na+、K+含量。
1.6 Gardos通道、RF的测定方法
按上述Shoeat等[3]的方法，制备并调整红细胞悬液浓度为50%Hct左右，Gardos通道测定管中加6mmol/L的盐酸奎宁，RF的测定管中加入6mmol/L 盐酸奎宁和12mmol/L丁苯氧酸，设对照管，各管均加入50%Hct红细胞0.1ml，加样后轻轻混匀，其余步骤同上。原子发射法测定各个样品管中的K+含量。
1.7 数据处理
SPSS统计软件，ANOVA进行显著性检验。
2 结 果
2.1 锌摄入水平对大鼠体重的影响（表1）
三组动物初始体重均衡性良好，2周后低锌、高锌组动物出现体重增长缓慢，4周后低锌、高锌两组大鼠体重明显低于正常锌组（P＜0.01）。
表1 锌对大鼠体重的影响 (?X ?s)
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组别 |
动物数 |
平均体重 (g) |
体重增长值 (g) |
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初始值 |
终值 |
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LZ |
10 |
34.83 ± 6.94 |
77.22 ± 15.2 a |
42.39 ± 10.0 b |
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NZ |
9 |
34.96 ± 4.60 |
95.72 ± 11.6 |
60.76 ± 8.3 |
|
HZ |
10 |
33.67 ± 5.21 |
78.38 ± 9.35 a |
44.71 ± 7.1 b |
2.2 锌与Na+/K+泵活性（图1）
图1A显示不同锌摄入量对大鼠红细胞Na+/K+泵转运活性的影响，饲料中锌含量为28mg/kg（正常锌组）时，K+ 离子通过Na+/K+泵的跨膜转运活性最大，低锌组和高锌组大鼠转运活性均降低；Na+的跨膜转运随摄入锌量增加其变化趋势与K+似乎相反，高锌组活性最大。图1B显示体外加入不同浓度后的锌Na+/K+泵活性的变化趋势，在加入锌浓度为5μmol/L时，K +离子的转运活性最高，其后则开始下降，Na+离子的转运在5μmol/L时也最活跃，但总的趋势不如K+ 。
(A)
(B)
2.3 锌与COTS-1的转运活性〔图2〕
图2A表示不同锌摄入量对大鼠COTS-1转运的影响，K +离子通过COTS-1的转运随锌摄入量的增高呈下降趋势，Na+的变化趋势与K+相反，随饲料锌的增加而呈上升趋势。图2B表示体外实验的结果，COTS-1的K+转运活性在加入5μmol/L Zn2+时变低，随后又有升高趋
势，但当加入锌浓度大于50μmol/L时活性又开始下降。锌浓度对Na+的影响比K+小，从整个
曲线来看Na+的变化趋势与K+基本一致。
2.4 锌与 COTS－2、Gardos 通道及 RF的转运活性（图 3）
由图3A可知，COTS-2和Gardos通道的转运活性均在正常组最大，摄入低锌或高锌饲料均抑制动物体内这两个通道的转运活性；而RF的转运活性在低锌摄入时最大，随着大鼠摄入锌量的增加，该通道转运活性呈下降趋势。
体外实验的结果显示，随着溶液中加入锌的增加，COTS-2和Gardos通道的转运活性都呈现先上升后下降的趋势，在加入5μmol/L Zn2+时活性最大，但Gardos通道在溶液中加入锌为500μmol/L时活性又回升；RF的体外转运结果与体内基本一致，随着溶液中加入锌的增加，RF的转运呈下降趋势，当溶液中加入500μmol/L Zn2+时，K离子的转运方向从原来的由内向外变为由外向内，即出现逆向的离子转运。如图3B所示。
3 讨论
Na+/K+泵又叫Na+，K+-ATP酶，与Ca2+泵（Ca2+，Mg2+-ATP酶）都属于基本主动转运途径[4]。Na+/K+泵对维持细胞内外的渗透压平衡和跨膜电化学梯度起非常重要的意义，该通道转运活性降低将影响细胞的正常生命活动。本次体内外实验结果均表明，适量充足的锌是保证K+离子主动转运活性的关键，过高或过低锌都会抑制Na+/K+泵转运K+的能力；锌对该通道Na+转运的影响不如K+变化幅度大，可能与Na+/K+泵的转运机制有关，也可能是由于Na+同时还存在其它类似的转运途径如Na+/Na+交换、Na+/氨基酸系统等，对Na+转运的降低起缓冲作用所致。
COTS-1属于次要主动转运途径，有很强的离子选择性，其重要的功能就是在Na+/K+泵活性降低时，它能代偿性地调节细胞膜两侧的Na+、K+浓度[5]。动物实验结果表明低锌时K+离子通过COTS-1的转运最为活跃。如前所述（图1A），低锌时Na+/K+泵的转运活性降低，COTS-1通过其部分代偿作用来维持细胞内的高K+状态；体外实验的结果也证明，在Zn2+浓度<50μmol/L时，COTS-1转运K+的活性随锌浓度的变化与Na+/K+泵相反，这进一步证明了它对Na+/K+泵的代偿作用。但当溶液中加入锌浓度＞50μmol/L时，COTS-1转运K+的能力又开始下降，说明过高浓度的锌可抑制该通道对Na+/K+泵的代偿作用。从总的趋势来看，Na+通过COTS-1的转运与K+的变化基本一致，但规律性不如K+明显（图2B）。
COTS-2是一个与COTS-1不同的K+/Cl-联合转运途径，属于载体介入性，正常情况下，该通道对维持细胞内外的K+平衡起一定的作用。体内外的实验结果证明，适量充足的锌也是保证该通道转运活性的关键，过高或过低的锌均会抑制COTS-2的正常跨膜转运功能（图3A、B）。目前有关COTS-2的研究比较少，有待进一步深入。
Gardos通道又称为Ca2+激活性K通道，是由Gardos1958年首次证明的。生理情况下由于Ca2+泵连续主动地泵出Ca2+，胞浆内的Ca2+浓度极低，不足以激活该通道，只有当胞浆内Ca2+浓度升高到一定水平时该通道才能开放。国内外资料显示，低锌和高锌均可使Ca2+泵活性降低[6] [7]，理论上该通道活性应增强，但本实验结果表明，低锌和高锌时该通道的活性低于正常锌，提示锌对该通道的影响较为复杂，可能还存在其它机制。
RF是指在所有已知转运途径均被抑制后的跨膜离子转运。生理情况下，RF对维持细胞膜两侧的离子平衡起一定作用[8]。本实验结果显示，随着锌浓度的升高，RF的活性下降，也表明了该通道对其他通道活性降低的部分代偿作用。体外实验当加入500μmol/L Zn2+时，RF呈现逆向的离子转运，提示当细胞内外的离子浓度有较大的变化时，RF可通过逆向转运K+来平衡细胞内外的离子浓度（图5A、B）。
总之，无论是体内还是体外，锌的水平高低与细胞膜的离子转运功能密切相关。适量的锌是保证 Na+/K+泵、COTS-2、Gardos通道转运活性的关键，过高或过低都会影响其转运功能，而COTS-1和RF对细胞膜两侧的离子紊乱可起到部分代偿作用，提示了机体的统一性和协调性。这些结果显示，锌对细胞膜转运功能的影响也许是解释锌作用的重要机制之一。
4. 参考文献
[1] Bettger WJ, O’Dell BL. Physiological roles of zinc in the plasma membrane of mammalian cells〔J〕．J Nutr Biochem, 1993,14:193-206.
[2] Ellory JC, Bowler K. Physiological and biochemical factors modulating red cell cation transport〔J〕． Stud Biophys 1988, 127: 215-221.
[3] Shohet SB. Red Cell Membrane〔M〕． New York: Churchill-Livingstone，1988,265-267.
[4] Nikinmaa M. Vertebrate red blood cells〔M〕． Berlin Heidelberg: Spring-Verlag,1990，99-121.
[5] 金颖． 红细胞膜的Na+/K+/Cl-联合转运系统〔J〕．生理科学进展，1991，22（1）：43- 46.
[6] 韩军花 杨月欣 何 梅等．锌对红细胞膜ATP酶活性影响的研究〔J〕．卫生研究，待发表.
[7] Johanning GL, Browning JD, Bobilya DJ et al．Effect of zinc deficiency on enzyme activities in rat and pig erythrocyte membrane〔J〕．Proc Soc Exp Biol Med，1990,195: 224-229.
[8] Hall AC．The temperature depend of passive K+ permeability in mammalian erythrocyte〔J〕. Cryobiology, 1986,23:395-405.
EFFECT OF ZINC ON THE TRANSPORT FUNCTION OF ERYTHROCYTE MEMBRANE
HAN Jun-hua，YANG Yue-xin，MEN Jian-hua，WANG Zhu
(Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100050)
【Abstract】Objective: To study the effects of zinc on transport function of erythrocyte membrane. Methods: This study was conducted both in vivo and in vitro. In vivo, weanling rats were divided into three groups and fed with different zinc diets(2.2,28 and 128mg Zn/kg diet) for four weeks, the transport function of Na+/K+ pump, COTS-1,COTS-2,Gardos and RF channels were determined; In vitro, different concentration of zinc(0,5,10,50,100 and 500μmol Zn2+/L) were added into fresh human blood and the activities of the five transport channels were detected. Results: Proper zinc could keep the highest activities of Na+/K+ pump, COTS-2 and Gardos channel. Too low or too high zinc decreased the transport function of these three channels and the activities of COTS-1 and RF channel were increased with the increase of zinc concentration, indicating the competitive function of these two channels. Conclusion: Zinc plays an important role in maintaining the transport function of erythrocyte membrane.
Key words: zinc; erythrocyte membrane; transport function
