|
马爱国，石学香，张秀珍，梁 惠，王 欣（青岛大学医学院医学营养研究所，青岛 ２６６０２１）
目的：氧自由基能攻击机体生物大分子造成脂质氧化、ＤＮＡ损伤。在青年人群中补充抗氧化营养素，观察对机体营养状况和抗氧化能力的影响，为合理补充营养素提供科学的依据。方法：本研究选择１０５例自愿参加的１８～２３岁在校大学生作为研究对象，随机分为服药组（５２人）和对照组（５３人）。服药组每人每天服用含维生素Ａ ３０００ＩＵ、β－胡萝卜素 １．５ｍｇ、维生素Ｃ ８００ｍｇ、维生素Ｅ ２００ｍｇ和硒 ３００μｇ的复合营养素片，对照组服用安慰剂，实验期为８周。实验开始和结束时收集对照组和服药组血样和尿样，分别进行血浆中抗氧化营养素和ＳＯＤ、ＧＳＨ、ＭＤＡ的测定ＤＮＡ氧化损伤的分析。结果：膳食调查结果显示抗氧化营养素维生素Ｅ和维生素Ｃ的摄入量基本达到了推荐摄入量（ＲＮＩ），维生素Ａ和硒严重不足，而维生素Ｂ１和维生素Ｂ２偏低。服药组干预后比干预前血浆中各营养素含量均明显升高，尤其是干预后血浆维生素Ｃ、硒和维生素Ａ分别升高了８５．１％、４５．０％和２３．８％Ｐ值均小于０．０１而干预后服药组与对照组相比，血浆维生素Ｃ、硒、维生素Ａ、β－胡萝卜素和维生素Ｅ分别升高了１１９．７％、１９．８％ 、２４．１％ 、３７．９％和２７．７％Ｐ值均小于０．０１。服药组干预后血浆中ＳＯＤ和ＭＤＡ水平明显低于干预前，而ＧＳＨ活性则升高了３６．３８％（Ｐ＜０．０１）。 Ｈ２Ｏ２（５０μｍｏｌ／Ｌ）诱发的淋巴细胞ＤＮＡ氧化损伤服药组明显低于（Ｐ ＜０．０１）对照组。 结论：补充抗氧化营养素能提高青年人群机体的抗氧化能力，使ＧＳＨ活性升高，ＭＤＡ降低；同时能有效减轻Ｈ２Ｏ２诱发的对ＤＮＡ的氧化损伤；而有关抗氧化营养素的补充使血浆ＳＯＤ活性降低及可能的作用机制尚需进一步研究。
关键词：膳食调查；抗氧化；维生素；Ｓｅ；ＤＮＡ损伤
前 言
氧自由基能攻击细胞内的任何结构和分子，造成脂质过氧化、ＤＮＡ氧化损伤１。在正常情况下，机体中存在着有效的抗氧化防御系统，包括酶反应体系（ＳＯＤ、ＧＳＨ－Ｐｘ、ＣＡＴ等）及非酶反应体系如维生素Ａ（ＶＡ）、维生素Ｅ（ＶＥ）、维生素Ｃ（ＶＣ）、β－胡萝卜素（β－Ｃ）、硒（Ｓｅ）等具有抗氧化作用的营养物质，可有效地清除自由基，降低ＤＮＡ损伤和脂质过氧化，维持细胞正常的结构和功能；相反，如氧自由基不能被机体及时有效清除，则可导致衰老、肿瘤等慢性退行性疾病的发生和发展２。维生素Ａ、维生素Ｅ、维生素Ｃ、β－胡萝卜素、硒等是人体所需的重要营养素，其抗衰老、抗氧化、抗肿瘤，增强机体免疫功能等作用已有定论３，４。近年来维生素的抗氧化作用及与ＤＮＡ氧化损伤关系的研究越来越引起关注。目前抗氧化营养素的研究多倾向于老年人群抗氧化应激、预防慢性病、预防癌症以及对ＤＮＡ氧化损伤保护作用的研究，而关于我国青年人群机体抗氧化能力和抗氧化营养素的营养状况研究甚少。因此，本研究目的是通过在青年人群中补充抗氧化营养素，观察和研究人体补充抗氧化营养素后是否能有效地提高机体的抗氧化能力，对机体内携带遗传信息的大分子物质ＤＮＡ是否起到有效的保护作用，减轻氧化损伤，为合理有效地补充营养素，降低慢性退行性疾病的发生和发展提供科学的依据。
１ 研究对象与方法
１．１ 研究对象 选择青岛大学医学院２０００级在校的两个班大学生，自愿参加本项干预研究，排除心脏病、肝炎、糖尿病等疾病，随机分为服药组和对照组。服药组５２人，男女各２６人，平均年龄１８．６３岁，对照组５３人，男生２５人、女生２８人，平均年龄１８．６８岁。服药组每人每天服用含维生素Ａ ３０００ＩＵ、β－胡萝卜素 １．５ｍｇ、维生素Ｃ ８００ｍｇ、维生素Ｅ ２００ｍｇ和硒３００μｇ的复合营养素片，而对照组服用外观包装和颜色相同的、不含有以上营养素的安慰剂，实验期为８周。
１．２ 营养状况调查及评价 采用２４ｈ膳食回顾法５。调查受试对象前一天摄入食物的种类和数量，参照中国食物成分表计算受试者每日各种营养素摄入量，并与相应的推荐摄入量（ＲＮＩ）比较６。测定身高和体重并按体质指数ＢＭＩ，体重（ｋｇ）／身高（ｍ２）评价受试者营养状况。血红蛋白（Ｈｂ）的测定采用氰化高铁法，男性Ｈｂ＜１３０ｇ／Ｌ ，女性Ｈｂ＜１２０ｇ／Ｌ为贫血。
１．３ 血样的采集 实验前后分别于清晨抽取空腹静脉血约６ｍｌ加入１０ｍｌ肝素抗凝的玻璃试管中，立即混匀，取２０μＬ用于血红蛋白的测定、１２０μＬ用于淋巴细胞ＤＮＡ损伤分析，剩余血经３０００转／分钟离心１０ｍｉｎ，取上层无溶血的血浆置于５ｍｌ带盖无锌塑料离心管中，于－２０℃保存，一个月内完成相关指标的测定。
１．４ 指标与方法
１．４．１ 抗氧化营养素分析：血浆硒、维生素Ａ和维生素Ｅ采用荧光分光光度法，分析仪器为Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司生产的ＲＦ－５４０荧光分光光度计。血浆总维生素Ｃ的测定采用２４－二硝基苯肼法。血浆中β－胡萝卜素提取采用环己烷萃取，普通比色法确定含量。标准品硒、维生素Ａ和维生素Ｅ均购自Ｓｉｇｍａ公司。
１．４．２ 抗氧化酶及ＭＤＡ测定 血浆中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的测定采用羟胺法谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）采用ＤＴＮＢ直接法丙二醛测定采用ＴＢＡ荧光法。以上三种指标的测定均采用试剂盒进行分析，由南京建成生物工程研究所提供。
１．４．３ ＤＮＡ氧化损伤分析 采用单细胞琼脂糖凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＣＧＥ）技术。ＳＣＧＥ是一种快速敏感的ＤＮＡ断裂损伤检测技术７。采用专用单位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓＡＵ）评价ＤＮＡ断裂损伤的程度８。
１．５ 统计分析 采用ＳＰＳＳ１０．０软件对数据进行整理和结果分析。服药组与对照组以及两组干预前后各项指标比较采用ｔ检验，显著性差异的界限值为Ｐ＜０．０５。
２ 结果
２．１ 营养状况分析
营养素摄入量 膳食调查结果显示对照组和服药组人群能量摄入均较ＲＮＩ偏低，男性为ＲＮＩ的８７％～９１％，女性为ＲＮＩ的８８％～９１％，以碳水化合物供能为主，约占能量摄入的６０％，抗氧化营养素ＶＡ、ＶＥ、ＶＣ和硒摄入量分析，ＶＥ、ＶＣ基本达到或超过了ＲＮＩｓ，ＶＡ、硒摄入严重不足，仅为ＲＮＩｓ 的５０％；而ＶＢ１、ＶＢ２为ＲＮＩｓ的７１％和７７％，钙仅占ＲＮＩ的５０％～７０％，明显低于ＲＮＩ，女性铁摄入量占ＲＮＩ的９０％，男性锌摄入不足，占ＲＮＩ的８０％。与１０年前相比，钙、ＶＡ、ＶＢ２摄入量仍不足，但较前有所升高，硒摄入量较前略有降低。说明目前青年人群ＶＡ、硒及钙的缺乏问题较突出，应注意膳食补充。服药组和对照组热量及各营养素摄入量均无显著性差异（见表１）。
营养状况的评价 两组人群体重均超过了１９９２年的全国成人平均体重（５６．２±１０．５），但根据ＢＭＩ分析可看出有８．７％的青年受试者ＢＭＩ在１８．５以下，营养状况欠佳；３．９％的学生ＢＭＩ在２５以上，出现了体重超重。血红蛋白测定结果显示男性贫血患病率为１．０％，女性为６．８％，低于１９９２年全国青年人群的１０％～２０％，这可能与人群膳食营养状况改善有关（见表２）。
２．２ 机体抗氧化能力分析
２．２．１ 抗氧化营养素水平
血浆抗氧化营养素分析结果见表３和表４。服药组干预后比干预前血浆中各营养素含量均明显升高，尤其是干预后血浆维生素Ｃ、硒和维生素Ａ分别升高了８５．１％、４５．０％和２３．８％Ｐ 值均小于０．０１而干预后服药组与对照组相比，血浆维生素Ｃ、硒、维生素Ａ、β－胡萝卜素和维生素Ｅ分别升高了１１９．％、１９．８％ 、２４．１％ 、３７．９％和２７．７％Ｐ 值均小于０．０１。对照组ＶＣ含量干预后比干预前显著降低，可能与试验期间的季节性新鲜蔬菜、水果摄入量低有关（见表５）。
２．２．２ 血浆ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性及ＭＤＡ水平
血浆中ＳＯＤ的水平服药后比服药前显著降低（Ｐ ＜０．０５），而ＧＳＨ干预后比干预前升高３６．３８％（Ｐ ＜ ０．０１）；脂质过氧化产物ＭＤＡ干预后比干预前降低６２．８５％，统计学分析有明显差异（Ｐ ＜０．０１）。
２．２．３ ＤＮＡ氧化损伤
ＤＮＡ断裂损伤分析结果显示服药组和对照组ＤＮＡ自发性损伤均较低。经氧化物Ｈ２Ｏ２处理后发现，低剂量组（１０μｍｏｌ／Ｌ）和高剂量组（５０μｍｏｌ／Ｌ）ＤＮＡ损伤的程度较自发性损伤明显加重，服药组干预前和干预后ＤＮＡ损伤有显著差异（Ｐ 均＜０．０１），对照组干预前和干预后ＤＮＡ损伤无差异（Ｐ 均＞０．０５）。服药组干预后经５０μｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２诱导的淋巴细胞ＤＮＡ氧化损伤比对照组明显减少（Ｐ ＜０．０１），见表７。
３ 讨论
维生素Ａ、维生素Ｅ、维生素Ｃ、β－胡萝卜素及微量元素硒是人体所需的营养物质和重要的抗氧化剂。本次调查发现青年人群中维生素Ａ、β－胡萝卜素及微量元素硒摄入不足。青年人群由于学习、工作和生活的压力较大，建议应在膳食中增加新鲜蔬菜、水果的摄入量，必要时可以服用一些抗氧化营养素的制剂，以增加血中抗氧化营养素的水平，抵御自由基对机体的损伤，促进身体健康。
Ｈ２Ｏ２是一种强氧化剂１０，可透过细胞膜在细胞核内与结合于ＤＮＡ上的Ｆｅ２＋或Ｃｕ２＋反应生成·ＯＨ，或者由Ｈ２Ｏ２诱导的氧化应激反应引起细胞内ＤＮＡ贮藏位点的释放。·ＯＨ的氧化能力很强，可直接作用于ＤＮＡ链，造成ＤＮＡ断裂或碱基氧化、交链等形式的损伤。本次实验采用不同浓度的Ｈ２Ｏ２作用于淋巴细胞，结果显示随着Ｈ２Ｏ２浓度的升高，ＤＮＡ的损伤程度也明显增加。服药组干预后与干预前相比，ＤＮＡ氧化损伤程度明显减轻，而对照组无差异。说明抗氧化营养素对Ｈ２Ｏ２引起的ＤＮＡ损伤有防护作用，可减轻其损伤程度。
维生素Ａ、维生素Ｅ、维生素Ｃ、β－胡萝卜素及微量元素硒抗氧化营养素在体内作为第二道防御体系发挥重要的抗氧化功能，降低ＤＮＡ氧化损伤。不同抗氧化剂有不同的作用机制，对ＤＮＡ损伤的防护作用机制可能有３种途径：①延迟ＤＮＡ损伤；②抑制ＤＮＡ损伤；③延迟兼抑制ＤＮＡ损伤。认为延迟作用代表抗氧化剂的抑制断裂性作用，如维生素Ｅ；而抑制损伤作用代表抗氧化剂的预防性作用；大多数抗氧化剂既有延迟ＤＮＡ损伤的作用，又有抑制ＤＮＡ损伤的作用１１。
各种抗氧化营养素共同保护机体免受各种氧化损伤，减轻各种有害因素对机体大分子物质包括ＤＮＡ的损害作用。维生素Ａ是一种脂溶性维生素，容易进入细胞膜，其侧链中的双烯共轭键是发挥其生物活性的必需结构，而分子中的双烯共轭键是单线态氧、羟自由基、脂质过氧化自由基以及其他自由基有效的淬灭剂和捕获剂，从而保护机体大分子ＤＮＡ免受氧化物的损伤１２。也有研究认为维生素Ａ没有抗氧化作用，但和维生素Ｅ协同用药可增强维生素Ｅ的抗氧化作用。其可能机制为联合服两种药物与单一服维生素Ｅ比较，ＳＯＤ有显著差异，说明联合用药可增强ＳＯＤ活性１３。ＧＳＨ－Ｐｘ与维生素Ｅ在抗氧化方面有协同作用，维生素Ｅ主要阻止过氧化物的产生，而含硒的ＧＳＨ－Ｐｘ则加速过氧化物还原成无毒性羟基化合物。硒和维生素Ｅ联用改善血脂的效果优于单纯应用硒和维生素Ｅ。Ｄｕｔｈｉｅ等１４发现膳食中补充维生素Ｃ、维生素Ｅ和β－胡萝卜素可使吸烟者和不吸烟者淋巴细胞ＤＮＡ的内源性氧化碱基损伤减少。通过给５０～５９岁健康男性补充维生素Ｅ、维生素Ｃ和β－胡萝卜素，可以有效地降低Ｈ２Ｏ２所致的ＤＮＡ损伤。本研究通过给青年人群补充维生素Ａ、维生素Ｅ、维生素Ｃ、β－胡萝卜素及硒后，服药组与对照组相比血浆中这５种抗氧化营养素达到较高水平，使组织和细胞中得到满足并发挥正常的生理和抗氧化功能，从而有效地清除氧自由基，降低Ｈ２Ｏ２所致ＤＮＡ氧化损伤。
ＳＯＤ是有效清除超氧化物阴离子自由基的一类重要的抗氧化酶，ＳＯＤ催化超氧阴离子（）歧化为Ｈ２Ｏ２和Ｏ２，然后再经过氧化氢酶的催化生成水，从而消除自由基的损害，其速度比生理ｐＨ下自我歧化高１×１０４倍１５。本试验中给服药组补充较大剂量的抗氧化营养素后，ＳＯＤ的活性下降，并与补充前有明显差异。许多动物实验及人群试验报道补充抗氧化营养素如维生素Ｅ、维生素Ｃ、Ｓｅ等可使ＳＯＤ的活性升高，并与抗氧化营养素的血清浓度成正比 １６，１７。本试验的结果却是降低，与以往文献报道不一致，可能的解释是营养均衡的健康青年人群，体内产生的氧自由基较少。由于补充了较大剂量的维生素Ａ、维生素Ｃ、维生素Ｅ、β－胡萝卜素和硒等抗氧化营养素后，及时有效地清除了氧自由基，使后者诱导的ＳＯＤ生成减少及活性降低。
总之，本研究的结果表明在青年人群中联合补充抗氧化营养素可以提高机体抗氧化营养素的营养状况和机体的抗氧化能力，增强机体清除氧自由基的能力；多种抗氧化营养素的联合作用能有效减轻Ｈ２Ｏ２对ＤＮＡ诱发的氧化损伤。有关抗氧化营养素的补充使血浆ＳＯＤ活性降低及可能的作用机制尚需进一步研究。
参考文献：
１ Ｓｃｈｒａｕｆｓｔａｔｅｒ Ｉ Ｈｙｓｌｏｐ ＰＡ Ｊａｃｈｓｏｎ ＪＨ ｅｔ ａｌ． Ｏｘｉｄａｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１９８８，８２１０４０－１０５０．
２ Ｂｌａｓｉａｋ ＪＧｌｏｃ Ｅ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｔａｍｉｎｓ Ｃ ａｎｄ Ｅ ａｎｄ ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ，２００２，１４０１１－１８．
３ 韩玉春，胡延基，刘祥朝，等．维生素Ｅ在体内抗脂质过氧化作用的研究．中华预防医学杂志，１９９３，２７（３）：１３２－１３４．
４ 周 琦． 补充多种维生素矿物质制剂能降低高血压和脑血管疾病的发生率． 中国临床营养杂志，２００１，９（２）：８５－８６．
５ 陈炳卿主编． 营养与食品卫生学． 第３版，北京：人民卫生出版社，１９９９． １０．
６ 杨月欣，王光亚，潘兴昌主编． 中国食物成分表２００２． 北京：北京大学医学出版社 ２００２． １２．
７ 马爱国，刘四朝． 两种ＤＮＡ断裂损伤检测技术敏感性的比较． 遗传 １９９７ １９１３２．
８ Ｃｏｌｌｉｎｓ ＡＲ Ｍａ Ａｉｇｕｏ，Ｓｕｓａｎ ＪＤ． Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｍｕｔ Ｒｅｓ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ １９９５ ３３６ ６９－７７．
９ 中国营养学会主编． 中国居民膳食营养素参考摄入量． 北京：中国轻工业出版社，２０００．
１０ Ｒｕｅｆｆ ＪＡ Ｂｒａｓ ＬＣｒｉｓｔｏｖａｏ Ｊ ，ｅｔ ａｌ ． ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈ２Ｏ２ ａｎｄ ６０Ｃｏ－ｙ－ｒａｄｉｔｉｏｎ．Ｍｕｔ Ｒｅｓ １９９３ ２８９１９７．
１１ 张健，曹恩华，秦静芬，等． 抗氧化剂对ＤＮＡ损伤的保护作用机制的研究． 生物物理学报，１９９７，１３（１）：１２３－１２６．
１２ 史奎雄主编． 医学营养学． 上海：上海人民出版社 １９９８．
１３ 刘雅明，华春珍，黄先玫． 联合口服ＶＡ和ＶＥ对正常家兔血清ＳＯＤ和ＬＰＯ的影响． 现代预防医学，１９９８，２５（１）：９４．
１４ Ｄｕｔｈｉｅ ＳＪ，Ｍａ Ａ，Ｒｏｓｓ ＭＡ，ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ＤＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９６，５６３：１２９１．
１５ 蔡美琴，等． 老年人抗氧化能力与营养素含量的关系 ．上海第二医科大学学报，１９９８，１８（６）：４７６－４７８．
１６ 吕宝经，赵美华，黄国芳，等．年龄变化与脂质过氧化损伤的分析．上海第二医科大学学报，１９９６，１６（１）：４０．
１７ 王水利，苏保风，强蕴蕴，等． ＣＯＰＤ患者红细胞膜流动性、氧自由基变化及抗氧化剂对其影响． 西安医科大学学报，１９９９，２０（２）：２０５－２０８． | 