达能营养中心第六届学术研讨会论文集

陆彩玲  郭松超

广西医科大学公共卫生学院， 南宁 530021

 

    锰是人体必需的微量元素，而长期慢性接触高浓度锰可引起麻痹震颤，肌肉张力失常为特征的锥体外系损伤的帕金森氏病（Parkinson’s disease, PD）症状。PD及慢性锰中毒有许多相似之处，如锥体外系变性，多巴胺耗竭，能量代谢，自由基与兴奋性氨基酸及钙离子紊乱有关 。近年来老年特发性PD发病率增高及三羰基甲基环戊二烯合锰（MMT）作为汽油添加剂的广泛使用，引起了人们对锰与帕金森氏病关系的关注。

    细胞凋亡（Apoptosis）或细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD）是与坏死不同的程控式细胞死亡机制，是维持生长发育及形态功能所必需的生理现象。非致死性病理性刺激可使细胞通过活化特定的信号分子，合成凋亡蛋白而进入预定的“自杀”程序，神经细胞凋亡的形态学表现与非神经细胞相似：细胞皱缩、核（染色质）浓缩、DNA裂解为185~200bp的片段而使电泳图谱上出现典型的“Ladder”条带。

   神经细胞凋亡是神经退行性疾病如帕金森氏病（Parkinson’s PD）、亨廷氏综合症（Hunting’s）、阿尔默茨氏病（Alzheimer’s）等神经细胞死亡的方式之一，许多体内外研究已经证实锰可选择性使多巴胺能神经细胞凋亡，本文从氧化应激、线粒体功能异常、Caspase活化、钙稳态失调等方面对锰致神经细胞凋亡的机制作一综述。

1         氧化应激

氧化应激（Oxidative stress ,OS）是指机体内氧自由基的产生与清除失去平衡或外源性氧化物的摄入过多导致反应活性氧（Reactive oxygen Species ,ROS）在体内堆积引起的细胞毒性^[1]。氧化应激已被证实既参与体外锰诱导几类细胞模型如PC₁₂细胞^[2]及HeLa细胞^[3]的凋亡，及大鼠体内锰神经毒性^[4]。多巴胺能PC₁₂细胞对MMT的急性毒性比其他非多巴胺能细胞更敏感，其ROS来源之一在于多巴胺本身，多巴胺可通过两条途径生成ROS及醌类物质。其一是单胺氧化酶氧化多巴胺生成H₂O₂及DOPAC^[5]。H₂O₂若不能被细胞的抗氧化物如GSH、GSH-PX清除则可与过渡金属反应生成O^2-、OH·，与脂质DNA及蛋白上的敏感氨基酸反应对细胞产生损伤，而作为过渡金属的锰可降低处理的神经细胞的GSH，GSH-PX。另一是多巴胺的儿茶酚胺环发生氧化生成多巴胺醌及ROS如H₂O₂、超氧阴离子。Mn可催化多巴胺的自氧化或非酶氧化^[6]。多巴胺醌缺乏电子极易与氨基酸、谷氨酰胺及蛋白质上的巯基发生共价修饰形成半胱氨酰基-多巴结合物（cys-DA）^[7]。游离巯基作为细胞及蛋白半胱酰氨基残基上的抗氧化物质时对蛋白质功能有重要作用。缺乏使细胞极易受到氧化应激的攻击。自氧化的多巴胺活化C-JUN,NFK/SAPK较多巴胺更迅速，诱导多巴胺断裂。而锰亦可活化胞浆JNK通路诱导PC₁₂细胞凋亡^[8]。有可能与锰抑制线体呼吸链生成过多的乳酸使胞浆变酸从而开启JNK通路有关。因为有报道胞外低PH可诱导A431及Swiss3T3细胞的JNK通路^[9]。介导MMT细胞毒的ROS的另一来源可能是受损的线粒体^[10]。

抗氧化功能下降是锰致神经细胞凋亡的另一机理。GSH可减少多巴胺醌或以其巯基团与多巴胺醌结合^[11]清除醌类物质，防止其与线粒体蛋白质结合而发生损伤作用。GSH、GSH-PX活力下降^[12]、抗坏血酸水平的降低^[13]亦在锰的神经毒性中起重要作用。另外，在神经系统中起抗氧化、营养作用的星形胶质细胞因富集锰而产生一系列生化改变，包括ROS生成增加，能量生成减少，抗氧化能力降低，谷胺酸盐载体活性下降等。抗氧化剂—N-已酰半胱氨酸及抗坏血酸可抑制锰所致的PC₁₂细胞的凋亡^[14]。间接提示了氧化机制的存在。

2 线粒体功能异常

线粒体与凋亡有关的变化包括跨膜电位的下降，反应活性氧的聚积，膜通透性的改变及释放凋亡因子^[15]。线粒体外被两层膜，外膜通透性较高，内膜有较高的离子选择性，有利于形成内外膜两侧的电势差及跨膜电位质子梯度。MMT可直接以剂量依赖方式降低原代培养的纹状体神经细胞及多巴胺能神经细胞的线粒体膜电位，使细胞出现DNA断片及胞浆检测到微管蛋白相关蛋白MAP-2。表明MMT诱导的神经细胞凋亡是附属于线粒体功能异常的^{[10, 16]}。MnCl₂处理多巴胺能神经细胞及胶质神经细胞（C6），前者的线粒体复合物明显受抑制^[17]，而线粒体复合物I抑制剂诱导的凋亡可能是通过线粒体通透转换孔的开放及线粒体膜电位崩解所致^[18]。线粒体通透转换孔的开放是对于ROS及电子传递链抑制剂的应答^[19]。Mn可催化多巴胺生成各种醌及ROS，抑制电子传递链。通透性的改变引起广泛的非特异性的凋亡蛋白经损伤的线粒体外膜释放到胞浆，激活caspase级联反应，放大凋亡信号。细胞凋亡是基因调控的需能过程，故ATP水平应与细胞生存及死亡方式密切相关，存在一能量阈值^[20]。富集线粒体的锰尚可直接作用于线粒体呼吸链，抑制顺乌头酸酶，致使线粒体产能障碍，当ATP合成低于该细胞的能量阈值时将启动细胞的凋亡。

3  Caspase活化

蛋白酶，尤其是称之为caspase，即半胱氨酸蛋白酶，在细胞的凋亡中起重要作用至今已有14种caspase被证实。它们大多以酶原形式存在于胞浆，并可被凋亡信号活化，介导凋亡级联反应。Mn²⁺可诱导Hela^[21]及NIH3T3^[22]细胞的凋亡独立于线粒体介导的凋亡之外，前者是caspase-3介导，且有ROS及锰超氧化物达的增加，而在NIH3T3细胞上的实验进一步证实caspase-3的活化是caspase-12诱导的，可能与Mn²⁺取代Ca²⁺活化蛋白酶Caplain，后者裂解Bcl-xl及caspase-12前体，从而使Bcl-xl抗凋亡作用丧失及caspase-12活化。 Chun HS等^[23]证实锰使黑质多巴胺能神经细胞SN4741凋亡是内质网应激异常、多种 caspase效应分子如：caspase-1、caspase-8、caspase-9参与的结果。Anantharam等以MMT处理PC₁₂细胞使caspase-3迅速活化，继之是与凋亡有关的靶物质的蛋白水解，尤其是PKCδ裂解为催化活性片段与调节片段，且与caspase-3之间存在着正反馈作用，进一步扩大了凋亡信号。但亦有研究表明，用caspase-3特异性的抑制剂DEVD-CHO及非特异性的caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK不能抑制PC₁₂细胞死亡，即Mn诱导PC₁₂细胞死亡也可以是不依赖于caspase-3活化的^[24]。

4  钙稳态失调

钙离子通过调节钙离子依赖的一系列蛋白酶如磷酸酶、核酸酶、蛋白酶等而在控制细胞的生理过程、细胞损伤及程序性死亡等方面起重要作用。钙离子稳态的维持有赖于如下几个方面的协调作用：①钙通道；②Na⁺/Ca²⁺交换系统；③钙稳态酶，Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase；④细胞内钙隔离系统（如线粒体，内质网）；⑤钙调素（CaM）。由于Ca²⁺功能的多样性及作用靶点、时程的不同使Mn对钙稳态的研究尚未非常明确。

重金属中毒损伤与胞内Ca²⁺稳态之间存在着密切联系^[25]。Mn可通过不同的机制干扰Ca²⁺的摄入、转运及释放而破坏其动态平衡。体外研究证实Mn²⁺是Na⁺/Ca²⁺交换的抑制剂，能阻断Na⁺/Ca²⁺交换^[26]，Na⁺/Ca²⁺跨膜转运的能量依赖于Na⁺-Ca²⁺-ATPase活化后产生的电化学梯度。Mn²⁺高浓度时可抑制Na⁺-k⁺-ATPase^[27]，从而间接抑制Na⁺/Ca²⁺交换。Mn²⁺亦可抑制维持胞内低Ca²⁺浓度的Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase的活性^[28]。该酶是钙调素(CaM)依赖性，Mn²⁺离子半径（0.080nm）与Ca²⁺离子半径（0.099nm）接近，可取代Ca²⁺激活CaM，胞浆Ca²⁺浓度过高，持续时间过长，CaM的活性异常升高，对细胞产生多种损害作用。Mn²⁺或许通过上述几个方面致Ca²⁺平衡失稳态。

胞浆内游离Ca²⁺的升高可激活某些蛋白酶，磷脂酶和内源性核酸酶，这些酶的活化可诱导细胞凋亡，另钙离子浓度升高可激活胞内信号转导途径，涉及到翻译后修饰调节凋亡下游效应器的蛋白酶和/或磷酸酶。Mn²⁺与Ca²⁺竞争线粒体膜上的同一单向转运体进入线粒体，且自线粒体清除速度极慢，抑制Na⁺依赖性的及非Na⁺依赖性的Ca²⁺移出线粒体^[29]，引起线粒体钙离子负载而使构成钙离子外流的通透转换孔（PT）开放，线粒体膜电位崩解，细胞色素C从线粒体释放到胞浆，激活caspase，表现出DNA碎片，凋亡小体等特征性变化^[30]。

综上所述，锰，作为人体必需的微量元素之一，长期高浓度的暴露使之选择性沉积在纹状体，多巴胺能神经细胞对其毒性更敏感。摄入的锰被隔离在线粒体，通过反应活性氧（来源于锰催化多巴胺氧化及受损的线粒体）、破坏钙稳态，使线粒体通透性增加，PT孔开放释放出凋亡因子到胞浆激活Caspase介导神经细胞的凋亡。

 

 

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