达能营养中心在全球

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达能营养中心第六届学术研讨会论文集

大豆异黄酮等对T2DM糖负荷后黏附分子表达的影响

朱翠凤  张帆   郭松超   徐晓燕1  戴雅丽1  韩令川1  蓝薇1
广东深圳市北京大学深圳医院营养科，深圳 518036
摘要： 目的 探索不同剂量的大豆异黄酮和VC、VE混合干预物对T2DM病人糖负荷后血液中黏附分子表达的影响。方法 筛选出120名已确诊的T2DM人，随机分入非干预组(B组)、低剂量(C组)、中间剂量(D组)和高剂量(E组)的大豆异黄酮和VC、VE混合干预物组，与正常对照组(A组)比较，同时进行OGTT，观察不同研究对象糖负荷后餐前和餐后1h、2h、4h、6h血液中黏附分子表达的影响。结果 OGTT过程中，A组、B组和C组血液中ICAM-1、E-selectin都显著增高，而D组、E组废除了这种现象，两组间无显著差异。结论 高血糖可产生过氧化压力而引起血液中ICAM-1、E-selectin的过度表达。由150mg大豆异黄酮和500mg VC、400IU VE组成的混合干预物，可作为T2DM人群以防治AS等并发症为目的的适宜摄入量。
关键词：  动脉粥样硬化  抗氧化剂  大豆异黄酮   VC   VE   黏附分子 

Effects of antioxidant on the expression of adhesion molecule
 in Type 2 Diabetes Mellitus

Zhang Fan, Zhu CuiFeng, Guo SongChao, Xu XiaoYan, et.al
Peking University Shenzhen Hospital, Dept. of  Endocrinology,  Shenzhen  518036

Abstract:  Objective  To investigate the effect of different dosages of antioxidant (Isoflavone, Vitamin C and E) on the expression of adhesion molecules in Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) patients. Method  Forty diagnosed T2DM patients were randomly divided into zero dosage (B) group, low dosage (C)group, medium dosage (D)group and high dosage (E) group with mixture of soy isoflavone vitamin C and vitamin E, comparing with normal blood glucose control (A) group, taking OGTT,  to observe the effect on expression of adhesion molecules during the OGTT procedure of fasting and postprandial 1h, 2hrs, 4hrs and 6hrs, respectively.   Result  During OGTT, sICAM-1 and E-selectin were found increased in group A, B and C, but not in group D or E (P<0.05). Conclusion Hyperglycemia can induce the over-expression of sICAM-1 and E-selectin due to oxidant. It was recommended to prevent T2DM complications such as atherosclerosis with the mixture at the dosage of 150mg soy isoflavone and 500mg vitamin C and 400 IU vitamin E.   
Key words: Atherosclerosis antioxidant soy isoflavone, Vitamin C Vitamin E  adhesion molecules  

糖尿病（Diabetes mellitus， DM）合并动脉粥样硬化病(Atherosclerosis，AS)是导致T2DM致残、致死的首要原因［1］，由于AS发病机理复杂，目前尚无理想的方法来根治AS病变。过氧化压力是一个普遍认可的糖尿病并发症的病理因素[2]，内皮细胞受到高血糖产生的过氧化压力等刺激后，可溶性细胞粘附分子-1（sICAM-1）、E选择素（E-selectin）等黏附分子(Adhesion Molecules  AMs)的表达增加。
大豆及其制品可降低血清胆固醇、LDL、VLDL，改善DM症状，并抑制动脉粥样硬块的形成。这主要归功于大豆中被称为异黄酮(isoflavone)的物质，其中金雀黄素(genistein,G)与大豆苷原(daidzein,D)是最主要的两种，G和D的抗氧化功能是近年研究的热点，但小剂量的异黄酮只表现出对药物代谢和抗氧化酶很弱的诱导作用，且单独给予异黄酮的抗氧化作用很微弱[10]。Wahlquist MT等[11]研究发现:补充摄入含异黄酮的食物其抗氧化效果比单独补充抗氧化剂的效果要好。可能与大豆异黄酮与食物中其它抗氧化剂的协同作用有关。本研究用大豆异黄酮和天然食物中广泛存在的抗氧化剂VC和VE协同作用，观察不同剂量的大豆异黄酮和VC、VE混合干预物对T2DM病人糖负荷后血液中黏附分子表达的影响。探索一种优化的组合达到有效的预防或延缓DM并发AS的效果。

1 材料与方法
1.1 对象选择
1.1.1 北京大学深圳医院内分泌科的门诊、住院T2DM病人，入选标准为：(1)30~80岁的男、女性。(2)按WHO（1999年）诊断标准确诊为2型糖尿病患者。(3)无肝、肾疾病，无胃肠手术史和严重影响脂肪吸收的疾病。(4)不吸烟或近每日吸烟量不超1包且吸烟史不超过5年。(5)近两周膳食脂肪占供热比不超过40%。(6)饮食加口服降糖药治疗，近4周用于降糖药物种类和剂量不变。(7)近1个月内未进行降血脂治疗。
1.1.2 正常对照组：健康自愿者无糖尿病、高血压病、高脂血症等疾病病史和家族史，年龄30~80岁，男女各半。
1.2 实验分组
按性别、年龄将研究对象分层，每层内按体重指数（body mass index, BMI）将研究对象分为BMI＜24和BMI≥24[12] 两组，并在年龄、性别、BMI分层的基础上，按入院顺序，随机将糖尿病人研究对象分为四个不同剂量混合干预物组(或空白组)。旨在保证各组间年龄、性别、体重的可比性。

分组：A组：正常对照组：只进行OGTT试验。
B组：糖尿病人非干预组：只进行OGTT试验。
C组：糖尿病人OGTT+低剂量混合干预物组(Isoflavone 50mg、VC 100mg、VE 50IU)。根据我国营养学会向健康人群推荐的膳食营养素参考摄入量[13]而设计。
D组：糖尿病人OGTT+中间剂量混合干预物组（Isoflavone 150mg、VC 500mg、VE 400IU）。参照文献资料，根据我国营养学会制定的适宜摄入量（AI），结合中国居民的膳食结构而设计[13]。
E组：糖尿病人OGTT+高剂量混合干预物组（Isoflavone 300mg、VC 1000mg、VE 800IU）。根据文献资料，结合中国营养学会提出的各种营养素的可耐受最高摄入量（UL）而设计的[13]。
1.3 体格测量：用统一的方法测量身高、体重、腰围、臀围、计算研究对象的体质指数（BMI）和腰臀比值。

1.4 OGTT试验：
1.4.1 膳食原则及内容：试验前：试验前3天食用碳水化合物量≥300g /d，并排除重体力活动，情绪激动，升糖药物等干扰因素。试验前一天晚餐后禁食（10~12 h）直至翌日早晨试验。试验日：试验日早晨食用特制的2两馒头一个（用富强面粉100g制成，含碳水化合物75g，进食时间不超过15min）。
1.4.2 受试对象：A、B、C、D、E组分别进食特制的2两馒头后，再同时进食不同剂量的混合干预物（或空白）。
1.4.3 地点：北京大学深圳医院内分泌科病房。
1.5 血样采集及预处理。
分别于餐前和餐后1h、2h、4h、6h从前壁静脉采血，采血量每次3~5ml。所采血样分别放入已预冷的加有Na2EDTA（1.4mg/ml）的无菌试管，立即置于冰水中保存。并于1h 内分离血浆分装后置于-20℃冰冻保存集中检测。
1.6 检测指标和试剂：
sICAM-1和E-selectin测定：采用北美晶美生物工程公司生产的ELISA试剂盒，用美国Rayto2100全自动酶标仪检测；
血脂、血糖、糖基化血清蛋白测定：用日本OLYMPUS AUTO640全自动生化分析仪检测。
1.7 统计分析
  用SPSS 10 For Windows 软件包建立数据库并进行处理分析。取单变量频数分布分析、列联表分析，用广义线性模型进行组间比较，采用最小极差法(LSD)进行两两比较。所有检验的显著性水平设在α=0.05。
2 结果
2.1 鉴于年龄、性别构成和体重指数的影响，本研究分组时对年龄、性别构成和体重指数这三个因素进行了控制，各组间均无明显差异(P>0.05)（见表1.1）。四组DM的病情及血糖、血脂控制情况也无明显差异(P >0.05)，但空腹血糖(FBG)、糖基化血清蛋白(GSP)都高于正常对照组(v<0.05),血脂指标中HDL-c比正常人偏低(P <0.05)。（见表2）
表1.  各组对象的一般情况 ( x±s)

项目
A 组
B组
C组
D组
E组
P
例数
15
15
15
15
15
NS
性别(男/女)
7/8
8/7
9/6
9/6
8/7
NS
年龄(岁)
67.00±15.90
69.50±13.22
64.62±10.40
68.88±8.32
63.89±11.23
NS@
身高( cm)
163.65±9.00
165.30±3.5
163.88±3.50
166.50±7.75
162.41±7.46
NS
体重（kg）
59.25±9.61
66.40±7.69
64.06±12.31
71.06±16.23
66.56±8.82
NS
BMI（kg/m2）
24.03±2.39
34.33±2.54
23.62±2.49
25.38±4.32
25.11±2.22
NS
腰围( cm)
88.20±8.44
86.20±8.24
89.62±8.40
95.75±11.90
90.78±10.73
NS
臀围( cm)
95.60±5.15
96.10±6.89
98.75±6.67
99.12±5.87
98.89±5.21
NS
腰臀比值
0.92±0.06
0.900.07
0.91±0.03
0.96±0.08
0.92±0.08
NS
注：@表示用列联表分析，其余用ONE—way ANOVA分析，NS表示组间差异无显著性。


表2.   各组对象的临床情况(x±s)

项目
A 组
B组
C组
D组
E组
P
例数
15
15
15
15
15
NS
糖尿病病程（月）
0.00 ±0.00
45.30±21.9**A
36.12±36.32**A
31.38±38.74**A
56.67±53.90**A
0. 018
空腹血糖（mmol/L）
5.06 ±0.46
10.22±3.08*A
10.02±3.81
9.24±3.45
10.48±3.57*A
NS
糖基化血清蛋白
163.20±30.48
232.50±108.98
214.1±48.31
282.3±126.90
241.86±73.24
NS
空腹血脂代谢状况
 
 
 
 
 
 
甘油三酯（mmol/L）
0.73±0.24
1.57±0.48
1.51±0.73
1.60±0.44
1.57±0.57
NS
胆固醇（mmol/L）
4.63±1.24
4.74±0.75
5.30±.0.78
5.90±1.35
4.80±1.01
NS
HDLc（mmol/L）
1.59±0.17
1.21±0.26**A
1.22±0.30*A
1.32±0.17
1.13±0.31*A
0.048
LDLc（mmol/L）
2.48±0.28
2.58±0.46
2.37±.021
2.44±0.17
2.49±0.18
NS
ApoAI (g/ L)
1.12±0.16
1.04±0.13
1.05±0.11
1.12±0.17
1.13±0.19
NS
ApoB  (g/ L)
0.64±0.15
0.67±0.14
0.78±0.10
0.83±0.24
0.72±0.17
NS
ApoAI/apoB
1.86±.58
1.62±0.41
1.38±0.32
1.45±0.41
1.66±0.43
NS
LP(a) ( mg/ L)
10.06±3.22
10.93±3.57**A
11.22±3.82*A
11.90±6.88
10.54±3.31*A
0.049
注：用one-way ANOVA分析。NS表示组间差异无显著性，**A表示与A组比较P<0.01,
*A表示与A组比较P<0.05。

2.2 各组研究对象OGTT后血液中粘附分子的动态变化。
2.2.1 sICAM-1的动态变化
本研究结果显示：四组DM人空腹水平的sICAM-1和E-selectin均显著高于正常人P<0.01。OGTT后，A组sICAM-1于餐后1h开始上升，至餐后2h达峰值，于餐后4h开始回落至空腹水平；B组sICAM-1在OGTT后1h即急剧上升P＜0.01，到餐后2h达峰值，与空腹比较差异显著P＜0.01，餐后4-6h仍居高不下；C组DM病人sICAM-1 在OGTT后1h也急剧上升P＜0.01，于餐后2h达峰值，与空腹比较差异显著P＜0.01，餐后4-6h也持续在较高的水平。D组在餐后1h轻微升高达峰值，但差异无显著性P＞0.05，于餐后2h即开始回落，很快于餐后4h回到空腹时水平。E组在OGTT过程中sICAM-1不升高反而轻微下降，至餐后2h达低谷，餐后4～6h逐渐回升至空腹水平。
2.2.2  E-selectin的动态变化
本研究结果显示：四组DM人空腹水平的E-selectin均显著高于正常人P<0.01。A组于OGTT后2h开始明显上升，至餐后4h达到峰值，但与空腹比较P＞0.05，餐后6h逐渐回落；B组于OGTT后1h即开始启动，餐后2h继续上升，于餐后4h达到峰值，比较空腹水平P＜0.01，餐后6h才逐渐向空腹水平回落；C组也具有同B组一样的上升趋势，于餐后4h达峰值，餐后6h仍高于空腹水平；D组在OGTT过程中，E-selectin于餐后1h轻微上升，于餐后2h达峰值，但与空腹水平比较差异无显著性P＞0.05，以后逐渐回落，于餐后6h达到空腹水平；E组在OGTT过程中，E-selectin不升反而逐渐降低，于餐后4h达到低谷，与空腹比较P＜0.05，到餐后6h又逐渐回升但仍低于空腹水平（见表3）。


表3.  各组研究对象OGTT后血浆中粘附分子的动态变化(x±s)

 
      空腹
餐后1h
餐后2h
餐后4h
餐后6h
sICAM-1（ng/ml）     P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
A组
    n=15
265.57±36.10
304.96±42.44
346.76±36.48
286.27±51.58
254.14±52.85
B组
n =15
478.22±96.192)A
526.95±103.632) A
606.84±110.34
515.64±122.98
509.37±114.14
C组
n =15
434.36±126.362)A
484.95±120.782)A
533.35±132.15
469.89±107.53
447.22±132.942)A
D组
n =15
468.26±96.372)A
488.79±103.422)A
486.83±116.622)A
469.37±115.86
448.64±105.492)A
E组
n =15
476.63±90.492)A
440.09±114.782)A
408.51±119.141)A
425.37±107.952)A
469.48±112.072)A
E-selectin（ng/ml）     P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
P<0.001
A组
n =15
55.21±14.14
60.57±19.39
69.63±17.23
77.88±16.75
64.66±18.04
B组
n =15
121.34±60.571)A
136.92±64.511)A E
152.27±71.691)A E
180.31±77.77
134.84±52.661)A
C组
n =15
156.99±64.401)A
161.71±60.04
176.38±61.79
210.63±65.70
167.06±59.851)AE
D组
n =15
134.58±74.291)A
141.51±70.171)A
142.59±69.761)A
140.96±83.821)A
136.44±74.311)A
E组
n =15
127.88±81.771)A
126.33±59.821)A
124.17±64.781)A
106.56±64.491)A
122.02±84.541)A

注：采用广义线性模型进行组间比较，用LSD法进行两两比较；1）表示(P<0.05)；2）表示 (P<0.01)；
 A、E表示与A组、E组比较。

3  讨论
高血糖导致sICAM-1、E-selectin等表达增加的现象主要是通过一种与过氧化压力有关但仍未完全明了的机制。已有证据表明：高血糖能引起一种细胞间的假性缺氧现象，产生细胞间的超氧化阴离子[14]，自由基在体外的缺氧条件下会调节sICAM-1、E-selectin等的过度表达，这种现象能被抗氧化剂所逆转[15]。因此，高血糖导致的假性缺氧状态可作为一种有效的刺激去激发ICAM-1、E-selectin等的过度表达。由于凝血酶能调节ICAM-1、E-selectin等的过度表达，而高血糖能引起凝血酶的过度生成（可能是由于过氧化压力的原因），自由基和凝血酶有顺序的作用导致了高血糖状态下sICAM-1、E-selectin等粘附分子的过度表达的现象[16]。
低剂量混合干预物对糖负荷后sICAM-1、E-selelctin的表达没有影响，而中间剂量和高剂量混合干预物都可消除sICAM-1、E-selelctin的上升趋势；提示在T2DM病人中只有较高剂量的大豆异黄酮、VC、VE混合干预物，才具有一定的抑制高血糖产生的过氧化压力对内皮细胞的损伤作用以及抑制内皮细胞sICAM-1、E-selectin的表达增加的作用。高剂量组比中间剂量组作用效果更加明显。但D组和E组之间无显著性差异P＞0.05。
血糖水平急性增加引起血浆中sICAM-1、E-selectin水平的急速上升的现象，不仅在糖尿病人中会出现，在正常人中也会出现。较高剂量的混合干预物平息了这种现象，可作为一个有力的证据支持这个假设即：过氧化压力和血糖水平能参与调节糖尿病人和正常人血液中sICAM-1、E-selectin等的表达。抗氧化性物质能控制高血糖导致的sICAM-1、E-selectin等的表达增加，提示高血糖、过氧化压力和糖尿病并发AS之间的因果关系的存在。
由于大豆异黄酮、VC和VE是本研究使用的抗氧化剂，它们对sICAM-1、E-selectin等黏附分子表达的直接影响是不言而喻的。由于本次研究中，大豆异黄酮和VC、VE能降低sICAM-1、E-selectin等血浆水平的现象只出现在高血糖的研究对象中，因此，关于大豆异黄酮和VC、VE的一定剂量的混合干预物能对抗高血糖对内皮细胞的过氧化损伤的假设是合理的。
综上所述，由50mg大豆异黄酮、100mg VC和50IU VE组成的低剂量混合干预物对sICAM-1、E-selectin等粘附分子的表达无抑制作用，这种针对健康人群的推荐的膳食营养素参考摄入量在防治T2DM慢性心血管并发症方面未出现明显效果。
由150mg大豆异黄酮、500mg VC和400IU VE组成的中间剂量混合干预物和由300mg大豆异黄酮、1000mg VC和800IU VE组成的高剂量混合干预物都具有明显的抑制内皮细胞在高血糖时sICAM-1、E-selectin等表达增加的作用，都具有预防T2DM人AS的形成和发展的作用，两组之间无显著差异性。
因此,本研究推荐：由150mg大豆异黄酮和500mg VC、400IU VE组成的混合干预物，可作为T2DM人群以防治DM合并AS的发生、发展为目的的适宜摄入量。

4 参考文献
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作者简介：朱翠凤, 女, 32岁，主管营养医师, 硕士，深圳市保健科技学会常务理事。
 广东深圳市北京大学深圳医院内分泌科(518036)；
 广西医科大学公共卫生学院营养系(510021)