达能营养中心第七届学术研讨会论文集

韩军花，杨月欣，门建华，边立华，杨晓光, 朱元招¹

（中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京，100050；¹农业部饲料工业中心，北京，100094）

 

摘要： 目的：研究和比较表达豇豆胰蛋白酶抑制剂基因大米（转SCK基因大米）和亲本大米中蛋白质和氨基酸的消化率的差异，从而探讨其生物利用率的异同。  方法：本研究选用猪为实验动物，通过外科手术法在其回肠末端放置T型瘘管，并分别喂饲转SCK基因大米和亲本大米，收集动物回肠末端消化产物，从而分析和计算两种大米蛋白质和氨基酸的消化率。结果：转SCK基因大米与亲本大米中蛋白质的表观消化率和真消化率相似；氨基酸消化率的测定结果显示，除亲本大米中赖氨酸的表观消化率与SCK基因大米相比有差异外，其余氨基酸的表观消化率和真消化率之间均无显著性差异。结论：外源性基因的插入未改变大米中蛋白质和氨基酸的消化率，在蛋白质和氨基酸消化率方法基本满足“实质等同性”的要求。

关键词： 转基因大米  表观消化率  真消化率

 

 

转基因食品在全球迅猛发展，其食用安全性是每个人首先考虑的问题。此外，转基因食品营养学方面还有许多令人担心之处。各种营养成分含量的变化、是否会出现新的抗营养因子和天然毒素、重要营养素的生物利用率是否发生改变等都是需要研究解决的问题。

水稻是我国居民的主要粮食作物，占我国粮食总产量的40%。提高水稻产量、防止病虫害一直是世界范围内农业技术上的重要任务。我国科学工作者经过多年的研究，培育出了表达豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的大米（转SCK基因大米），经田间实验证明，对绝大部分水稻害虫有较强的抑制作用。

本研究选取转SCK基因大米，利用实质等同性原则和个案分析原则对其进行营养学评价。由于该转基因大米转入了由豇豆中提取出的胰蛋白酶抑制剂基因，该外源基因在食物中表达的蛋白本身是否容易被机体降解、其表达的胰蛋白酶抑制剂是否是会影响到大米中蛋白质或氨基酸在小肠内的消化吸收情况，这些都是评价其营养学价值时首先应该考虑的问题。

本研究利用实验猪回肠末端T型插管技术，收集动物回肠末端的消化产物，对转SCK基因大米和亲本大米中蛋白质和氨基酸等重要营养素的生物利用率进行比较，以期为转SCK基因大米全面的营养学评价提供系统数据，并为建立转基因食品营养学评价体系提供参考。

 

 

转基因水稻与亲本水稻来自中国科学院遗传所福建基地，该基地地处东经116’40、北纬26’06，海拔130米，土壤为沙壤土。受试大米于2002年6月20日播种，7月14~17日插秧，采用湿润育秧，秧龄26~29天。8月8日烤田，8月25日复水，9月16~18日抽穗，10月23~27日收获。水稻收获后储存于阴凉干燥处，通风良好。实验前在北京房山粮食加工厂经相同的脱壳处理（不进行刨光加工），保持其谷粒的完整性，抽真空保存，备实验用。

从北京市昌平县流村猪厂挑选健康去势公猪（杜洛克×长白×大白） 10头，术前单个放入代谢笼内，适应喂养7天，期间行肠道驱虫处理。禁食36小时，禁水12小时后，行腹腔外科手术。动物的手术和食糜的收集实验均在农业部饲料工业中心代谢实验室进行。

按照霍启光等^[1]的方法进行手术。术前用1mg/kg体重的盐酸氯氨酮对实验用猪进行全身麻醉后，左侧卧位保定于手术台上。常规外科手术方法消毒后，在腹中线上方20cm，下肋骨约10cm处，纵向做长约6cm的切口，分离内外腹斜肌，剪开腹膜，顺肠管向后找到回盲部。在距回盲瓣10cm处的回肠上作一长约4cm的切口，将瘘管凹端放入，绕瘘管行小肠荷包缝合。然后将瘘管送回腹腔，在距原切口头侧5cm处另做一切口，引出瘘管，并用螺母固定，注意勿使肠管扭转。逐层将腹膜、肌肉及皮肤缝合，用酒精和碘酒消毒手术部位。

在适应期和手术恢复期内猪饲料的营养水平达到或超过NRC（1998）的营养水平。动物术后的恢复期为15天。详细记录代谢室内的温湿度和每头猪的摄食情况。前7天每日给猪注射青霉素80万单位，每日两次。手术部位用碘酒和酒精擦拭，保持清洁以避免感染。术后7天拆线，并用氧化锌-凡士林软膏对创口部位进行护理。

将脱壳后的大米样品磨碎，并过20目筛。添加1%的大豆色拉油以增加适口性和避免饲料粉尘。按0.1%的比例加入指示剂三氧化二铬。

挑选术后恢复良好、进食正常的实验猪6头，实验前期先测定每头动物的内源性氨基酸排出量，即给动物喂饲含5%酪蛋白的饲料，适应期5天，观察并记录每头实验用猪的进食量，6~7天收集食糜，以测定和计算内源性氮或氨基酸的排出量。随后将动物分成两组，其中4只动物给予转基因大米饲料，另2只给予对照大米饲料，同样适应5天后连续收集两天的食糜。第一期实验结束后，每头动物均更换为另一种饲料，即4只给予对照大米饲料而另外2只给予转基因大米饲料，重复以上实验步骤。每天饲料量为动物体重的3%~4%，料水比为1：2.5，每天早8：00和晚18：00各喂饲一次。

    从早8：00到晚18：00连续收集食糜10个小时，食糜排出后通过医用肛门圈收集到封口塑料袋内（可避免收集食糜过程中牵动瘘管，有利于实验猪的健康和防止瘘管脱落）。根据每只动物食糜的排出情况每1~2小时收集一次，并马上置于-20℃的冰柜中保存备检。

实验结束后，将每头猪每期的食糜样品解冻后混合均匀，各取部分样品进行冷冻干燥。并在室温下回潮成风干样品，再经粉碎处理制成40目粒度的分析样品，装入封口塑料袋中低温保存备测。

大米、饲料、食糜中氮含量的测定：微量凯氏定氮法^[2]；

饲料、食糜中18种氨基酸含量的分析采用三种水解法进行，色氨酸以4.2mol NaOH水解；胱氨酸以过甲酸氧化法处理；其余16种氨基酸以6mol HCl水解；自动氨基酸分析仪进行测定^[3]；

饲料和食糜中铬含量采用湿消化法^[4]，（硝酸：高氯酸为4：1），用原子吸收分光光度计（VARIAN  AA200）测定。

植酸含量的测定采用国标法 GB/T 17406-1998“食品中植酸的测定”。

氮和氨基酸回肠末端表观消化率的计算公式为^[5]：

                  饲料中Cr含量      食糜中氮或氨基酸含量

表观消化率=100—{————————×————————————}×100

                  食糜中Cr含量      饲料中氮或氨基酸含量

内源性氮和氨基酸排出量的计算公式为：

                                                   饲料中铬含量

内源性氮或氨基酸排出量 = 食糜中氮或氨基酸含量×—————————

                                                   食糜中铬含量

真消化率的计算公式：

                         内源性氮或氨基酸排出量

真消化率= 表观消化率 + ——————————————×100

                          饲料中氮或氨基酸含量

所有数据输入数据库中采用SPSS 11.0统计软件进行分析，比较转基因大米和对照大米回肠末端氨基酸表观消化率和真消化率的差异，以P<0.05为显著性检验水平。

对转基因大米和亲本大米中的蛋白质、氨基酸、植酸等含量进行了测定比较，结果表明转基因大米和亲本大米中以上各项的含量基本近似，如表1所示：

Table 1 The comparison of protein, amino acids, phytate content in GM and parental rice

 

     消化率可反映蛋白质在体内消化酶作用下被机体分解的程度，以食入的氮或氨基酸量减去粪便中的量再除以食入量的百分率来表达。消化率包括表观消化率和真消化率，两者的区别在于是否考虑内源性氮或氨基酸排出量。如果不考虑内源性氮或氨基酸排出量，则为表观消化率，反之则为真消化率。由于忽略了内源性排出量，表观消化率常常低估了蛋白质的消化，且常常随蛋白质摄入量的增加而增加，但由于其简单易行，故仍常用来评价食物中的蛋白质质量。真消化率则可较准确地评价蛋白质的实际消化程度，且不受蛋白质摄入高低的影响^[6]。表2结果显示了两种大米中蛋白质和18种氨基酸的表观消化率。

Table 2  Apparent digestibility of GM rice and parental rice （%）

       note：*means statistically significant in parental rice and rice genetically modified with cowpea trypsin inhibitor.

     由上表可见，转基因大米和亲本大米中蛋白质的表观消化率类似，均在70%左右。各种氨基酸的消化率多介于60%~80%之间，除了转SCK基因大米中赖氨酸的消化率与亲本大米相比有显著差异外，其余17种氨基酸的表观消化率未见明显差别。

本实验利用能完全吸收的5%水解酪蛋白饲料测定了受试动物内源性氨基酸的排出量，以每摄入饲料中某氨基酸1kg时回肠食糜中所排出的相应氨基酸的g数表示，如表3所示：

Table 3：the endogenous amino acids flow (g/kg intake)

Note: “EF” means endogenous flow

将上述氨基酸排出量代入真消化率的计算公式，计算并比较转基因大米和亲本大米中各种氨基酸的真消化率，结果如表4所示：

Table 4：Ture digestibility of GM rice and parental rice（%）

        #: if the value is more than 100%, it is expressed as 100%。

      由表4结果可见，两种大米中蛋白质的真消化率均在90%以上，且两者无明显差别。除异亮氨酸真消化率值在转基因大米和亲本大米中均低于80%外，其余氨基酸的真消化率均在80%以上,在两种大米间无明显差别。

 

通过测定粪便（即肛门取样法）中氮和氨基酸含量来评价蛋白质和氨基酸消化率已经受到了许多质疑。主要原因是因为大肠中的微生物对未消化产物的发酵作用，影响了氮的排出量，Mason认为粪便中62%~76%的氮来自细菌^[6],结果导致高估了蛋白质和氨基酸的生物利用率（约高5%~10%）。回肠末端取样法可以解决这一方法上的缺陷。该法是通过外科手术在回肠末端造口或施以回-直肠吻合术，收集回肠消化液进行测定，一般选用的实验动物是猪，在回肠末端做T型管，并开口于体表，收集回肠消化产物进行测定。经大量实验证明，回肠末端取样法比肛门取样法准确，可以更直观地反映食物在小肠内的消化情况。

上述无论是肛门取样还是回肠末端取样，都需要收集动物的全部消化产物进行分析。但通常收集动物的全部消化产物比较麻烦，也容易造成较大的实验误差。指示剂法可避免全收粪带来的麻烦，比较省时省力。用做指示剂的物质的选择条件是必须不为动物消化和吸收，在饲料和食糜中均匀分布并且有很高的回收率^[7]，一般可分为外源性指示剂和内源性指示剂。最常用的外源指示剂是三氧化二铬（Cr₂O₃），文献中国内外学者测定不同饲料中Cr₂O₃的回收率在85%~110%之间。

测定任何蛋白质的真消化率，必须先测定出实验动物的内源性氮或氨基酸的排出量。国际上测定内源性氮或氨基酸排出量的方法有无氮饲料法、无氮饲料加静脉平衡氨基酸法、同位素标记法、酶水解酪蛋白饲料法等。无氮饲料法是最经典的测定内源性氮和氨基酸排出量的方法。但由于缺乏蛋白质或肽对消化酶分泌的刺激作用，许多学者认为会低估氨基酸的排出量^[8]。国内外学者研究认为5%酶解酪蛋白从理论上可以完全吸收，且对消化道内源性氨基酸分泌的刺激作用明显，可真实地反映机体内源性氨基酸的排出情况。

本研究采用实验用猪为实验动物，采用回肠末端T-型瘘管术，三氧化二铬作为指示剂，用5%酶解酪蛋白饲料测定该批动物的内源性氨基酸排出量，并采用交叉法给动物分别喂饲转基因大米饲料和亲本大米饲料，比较两种大米氮和氨基酸表观消化率和真消化率之间的差异。由表2和表4结果可见，转基因和对照大米中氮或蛋白质的表观消化率在70%左右，真消化率则均在90%以上，比FAO/WHO1989年公布的《Protein quality evaluation》^[6]中列出的刨光大米真消化率为88%的值略高，可能是由于大米样品的不同或代谢方法的不同所致；各种氨基酸的表观消化率多分布于60%~80%之间，而真消化率则分布于80%~100%之间，且两种大米中绝大部分氨基酸的表观消化率和真消化率之间均无显著差异(P>0.05)，仅转基因大米饲料的赖氨酸表观消化率显著低于亲本大米（P <0.05），但赖氨酸的真消化率两者之间则无明显差异。说明转基因大米与亲本大米在蛋白质和氨基酸消化率方面基本满足实质等同性的要求。赖氨酸表观消化率的差异是否与转入的外源基因表达的蛋白质有关，则值得在今后的研究中进一步探讨和确定。

致谢：福建省农科院农业遗传工程重点实验室王峰教授提供实验用转基因大米和对照大米材料，保证研究工作的顺利完成，在此表示深深感谢。

 

1 霍启光. 饲料生物学评定技术[M]. 北京: 中国农业出版社, 1996. 120-126

2 GB/T5009.5-85. 食品中蛋白质的测定方法[S]

3 GB/T 14965-1994. 食物中氨基酸的测定方法[S]

4 白露，张丽英，李德发，等. 铬火焰原子吸收光谱法测定条件改善探讨[J]. 中国饲料, 2002,  22：21-23

5 Sauer,W,C, M,Z Fan, R,Mosenthin et al. Methods for measuring ileal amino acid digestibility in pigs. In: Farm Animal Metabolism and Nutrition[M]. Eds: J.P.F.D’Mello. 2000. CAB International, 279-306

6 Protein quality evaluation. Report of a joint FAO/WHO expert consultation [M]. Bethesda, USA, 1989

7 杨凤. 动物营养学[M]. 北京：中国农业出版社，1993. 167-171

8 Moughan PJ, Smith WC, Schrama J, et al. Chromic oxide and acid-insoluble ash as faecal markers in digestibility studies with young growing pigs[J]. J Agri Res, 1991,34:85-89

 

THE COMPARISON OF ILEAL DIGESTIBILITY OF PROTEIN AND AMINO ACIDS IN GM RICE AND PARENTAL RICE

【Abstract】 Objective: In order to compare the digestibility of protein and amino acids in parental rice and rice genetically modified with cowpeas trypsin inhibitor. Methods: 6 experimental swine were surgically fitted with simple T-cannula at the terminal ileum, and fed with parental rice and rice genetically modified with cowpeas trypsin inhibitor alternately, the ileum digesta were collected for determination of apparent and true digestibility of protein and amino acids. Results: The apparent and true digestibility of protein is similar in these two types of rice. Except the apparent digestibility of lysine, there are no statistically significant in the apparent and true digestibility of other 17 amino acids. Conclusion: The digestibility of amino acids is not changed by the insert of foreign gene, so it can meet the request of “substantial equivalence” in protein and amino acids digestibility.