达能营养中心第七届学术研讨会论文集

图１：RR 大豆的CaMV35S启动子PCR扩增

食用油样品	结果	农科院检测结果
绿1大豆	+	+
金2大豆	+	+
福3大豆	+	+
四4大豆	+	+
大5大豆	+	+
北6大豆	+	+
汇7大豆	+
元8大豆	+	+
黑9大豆	—	—
火10大豆	+	+
良11大豆	+
海12大豆	+
美13玉米	+
古14玉米	+
金15玉米	+

图18：玉米样品Real-time PCR的溶解曲线图

图19：玉米样品的Real-time PCR标准曲线图

 

 

表3：所检测样品的GMOs准确含量：

 

 

自从1983年世界上第一株转基因植物诞生以来，转基因作物源源不断地走出实验室进入田地并商品化。尤其近几年，转基因作物获得了很大的发展，其种植面积迅速增长。其中，99%的转基因作物的种植集中在美国，阿根廷，加拿大和中国等几个国家。在各种转基因作物中，以转基因大豆的种植面积最大，其次为转基因玉米和转基因棉花。目前，世界上已经商品化进入市场的转基因作物主要有转基因大豆，玉米，棉花，油菜籽以及烟草，水稻等种类；转基因蔬菜主要有转基因马铃薯，番茄，甜菜等种类。这些转基因作物和蔬菜主要能抗除草剂，如大多数转基因大豆能抗草丁膦或草甘膦等除草剂；抗虫，如许多转基因玉米能抗玉米螟；或者两种性状同时具备；有的转基因蔬菜则是为了延迟成熟，延长储存期，另外还有的转基因作物是为了增加某种营养成分，现在，用于这种目的的转基因作物得到了很大的发展。目前，我国市场上出现的转基因产品还主要是进口的，我国自行开发的主要是转基因蔬菜以及转基因水稻等，一些种类业已经商品化并进入市场。

目前，由于越来越多的消费者对转基因食品的安全性提出了质疑，认为转基因食品有可能对人体的健康产生不良影响，并对环境和物种的进化与多样性造成影响，因此，转基因生物（包括植物，动物和微生物）发展遇到了很大的阻力。为了消除消费者的疑虑和担忧，需要在食品上进行标示，让消费者有知情权，可以自己决定是否选择转基因食品。这就需要对转基因食品进行检测。

对转基因产品的检测方法目前主要有两类：DNA检测方法和蛋白质检测方法。其一，DNA检测，包括转入的公共基因元件和目的基因。利用PCR方法扩增转入的一些公共基因元件，包括CaMV35S启动子，NOS终止子和nptII基因等，检测这些基因元件可以用来筛选是否为转基因作物，但这种筛检手段存在一定的假阳性率；而检测目的基因，即对转入的起作用的基因检测，如检测RR大豆的EPSPS基因等，即可知道所转入基因片段的种类；还需要对作物本身的house-keeping基因进行检测，以判断所检测的食品样品中所含作物的种类，达到追根溯源的目的。现在，国内外的所能检测的主要作物集中在大豆和玉米等几个种类上。其二，蛋白质检测，即检测转入的目的基因所表达的蛋白质，目前主要利用ELISA方法。

目前，DNA和蛋白质检测都存在着相当大的局限性，即检测的通量太小，未来的发展趋势是研发高通量的检测技术。对于DNA 而言，国内外正在开发DNA芯片技术；而蛋白质，随着蛋白质组学的理论和技术的日渐成熟，有可能开发出一种高通量检测技术。

对于转基因食品来说，检测程序应该包括如下步骤：（1）对食品的house-keeping基因进行检测以确定食品所含有的作物种类；（2）对插入的公共基因元件CaMV35S 启动子和NOS终止子进行检测，以筛选是否含有转基因成分；（3）对转入的目的基因进行检测，以判断转入了何种外源基因。

DNA检测中的具体步骤包括：（1）食品基因组DNA的提取；（2）CaMV35S 启动子和NOS终止子的PCR扩增；（3）对食品的house-keeping基因的扩增；（4）利用限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行确认与描述。

本研究拟在我国建立并改进上述已存在的检测技术。

（一）DNA提取方法的改良

DNA的提取是此检测方法中的关键的一步，它的效率高低直接决定着后面PCR的成功与否。现在从植物和食品中提取DNA主要采用CTAB方法^[14-16]和Wizard^[17-19]方法，以及SDS/蛋白酶K^[20,21]方法。在一篇文献中，对9种DNA提取方法进行了比较，其中CTAB方法代价低，所用时间较少，而且提取的DNA 质量比较高，但产量较低^[22]。对于不同的食品形式，应该采取不同的DNA提取方法。对于均匀的食品，如豆腐，豆粉等，可以利用普通的CTAB方法。我们对豆腐和豆浆粉以及豆粉等食品，则采取了CTAB方法，但是和“精编分子生物学实验指南”所提供的方法相比，作了一些改进。“精编分子生物学实验指南”提供的方法所需要的样品量比较多，而且使用的试剂多，所需要的时间更长，而我们改进以后，这个方法更简单，容易操作，节省时间。对于原材料，如直接利用大豆和玉米磨的粉，可以使用试剂盒方法，因为试剂盒方法需要的初始量少，或者利用CTAB方法提取DNA，然后利用试剂盒对提取的DNA进行纯化。经过精炼的大豆色拉油和玉米油，其中的DNA含量非常低，因此，常规提取方法很难提取出DNA，我们尝试了不同的提取方法，曾经利用CTAB方法进行过提取，但是，提取出来进行普通PCR后，在琼脂糖凝胶电泳上没有观察到结果，我们又采用Real-time PCR，可以得到转基因阳性结果，但是利用普通CTAB方法提取DNA，效果不好，而且不稳定，重复性不好。因此，需要利用专门的方法来提取，本方法采用农科院生物技术研究所开发的专门用于提取食用油基因组DNA的试剂盒进行DNA的提取，提取的食用油DNA适合于后面的PCR扩增。在这种提取方法中，非常关键的一点是在开始的两步中要利用磁力搅拌器充分搅拌，这一点非常重要。

（二）DNA定性检测：

本方法是一种筛检方法，所以主要检测一些公用的外源基因元件-CaMV35S启动子和NOS终止子。CaMV35S启动子来自于花椰菜病毒，也可以天然存在于某些十字花科植物中。花椰菜病毒是很少的几种DNA双链的植物病毒，因此经常被用来将外源基因引入到植物中^[7]。因为它能在很多植物中有效的表达，而且有增强子的作用^[8]。NOS终止子来自于土壤杆菌属，是胭脂氨酸合酶基因，它天然存在于植物病毒的Ti质粒中^[9]， 主要用来结束转入基因的转录。目前进行检测的PCR方法也主要是基于这两段基因^[10-13]。

PCR

PCR，是本方法整个程序中的一个必要的部分。PCR技术已经发展的比较成熟，已常规应用于分子生物学中，但以前主要应用于一些基础研究中，现在，这项技术已越来越多的应用于食品分析中^[5]。在PCR中，引物的选择，Mg²⁺的浓度，退火温度，以及提取的DNA是否存在PCR反应抑制剂等等因素都能影响PCR的进行。在进行玉米粉标准品的PCR扩增时，其35S的扩增效果就不如大豆的效果，因为玉米中的淀粉含量更高，而且其中的多酚类物质也比较多，因此对PCR反应影响比较大。因此还需要对如何更好的除去这些抑制剂进行研究。

Nested-PCR

Nested-PCR是一种特殊的PCR方法，它对某一段基因进行两次扩增，两次扩增所用的引物不同，第二次扩增时的引物是从第一次的PCR产物中所选择的，因此，第二次PCR的产物的长度小于第一次PCR产物的长度。NOS终止子经过nested-PCR后，如果出现104bp的序列，即可以确定是NOS终止子。大豆的Lec基因是大豆的特征性基因，我们在检测豆粉时，采用普通的PCR方法，扩增的片段为414bp；但是我们在扩增大豆色拉油的Lec基因时，采用普通PCR方法并没有扩增出来，农科院单纯采用了一对引物也没有扩增出来，可能在DNA提取时，基因组DNA受到破坏，Lec基因发生了断裂，因而无法扩增，因此我们又另外设计了一对引物，采用了Nested-PCR方法，结果可以扩增出来，得到118bp的DNA片段。Nested-PCR具有很高的灵敏性和特异性，因此，即使食品中的这段基因的含量很低，也可以检测出来，同时，由于它的高度特异性，如果采用Nested-PCR的结果为阳性，则可以直接说明食品中含有这段基因，而不需要再利用别的方法来证实，这样就可以消除结果的假阳性和假阴性。

利用限制性内切酶对35S产物进行证实：

由于CaMV35S启动子在进行PCR时有可能会出现非特异性条带，因此，为了证实所得到的电泳条带，需要利用限制性内切酶进行切割，以证实所得到的条带确实为CaMV35S启动子。限制性内切酶XmnI的特异性的切割位点是          

5′-GAANN▲NNTTC-3′

5′-CTTNN▲NNAAG-3′，利用XmnI可以将CaMV35S启动子切割成两条带，80bp和115bp。在图1和图2中，含量为0%的泳道都在200bp左右出现了条带，这就需要利用XmnI来进行证实，在图3和4中，利用XmnI酶切以后，0%的条带没有消失，说明该条带不是35S，而其它的条带则分为两条，分别为80bp和115bp，则可以证实为35S，可以消除假阳性结果。

    以食用油为检测样品，本研究者与农科院生物技术研究所同时对市场上相同品牌的大豆色拉油和玉米油进行了定性检测，结果完全一致。

（三）DNA定量检测：

    DNA的定量检测目前主要有内参照PCR法，竞争性定量PCR方法和Real-time PCR方法，其中Real-time PCR方法是目前最先进的PCR定量技术，主要应用于基础医学中，检测某些致病菌或病毒等等^[23]。现在也开始应用于转基因食品的检测领域中。Real-time PCR根据其原理不同可以分为几种，目前最常用的有TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法，我们使用的是TaqMan荧光探针法。其原理如下：

  PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两段分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭集团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，根据收集到的荧光信号就可以得知所要检测的DNA的量了。

Ct值：在Real-time PCR中，Ct值是一个非常重要的参数，其含义是每个反应管中的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系^[24]，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可以作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可以从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，进而得到食品样品中的GMOs的准确含量。

Real-time PCR的TaqMan荧光探针法工作原理图

 

                  本研究利用PCR方法建立了食品中的转基因组分（GMOs）的检测方法，包括定性和定量的方法。定性采用普通的PCR或nested-PCR方法扩增，并采用限制性内切酶对扩增产物加以切割来进一步验证，以消除假阳性和假阴性，检测限可以达到0.1%；定量则采用Real-time PCR方法。并就各种不同食品中的DNA提取的CTAB 方法加以改良。在此基础上，我们基本在转基因食品方面建立一个国际参比实验室。

1.        转基因食品的定性检测：

l        PCR扩增：对35S启动子和NOS终止子进行PCR扩增，在本研究中，我们所检测的结果与提供的标准品完全符合。对食品本身的特征性基因也进行了扩增，以判断该种食品来自于何种作物。同时，我们还需要对转入的目的基因进行检测，以判断所转入的基因种类。

l        利用限制性内切酶对35S启动子进行酶切可以证实PCR扩增产物，nested-PCR方法也可以证实NOS终止子和Lec基因的存在。根据报道，普通PCE方法检测存在一定的假阳性率和假阴性率，因此，我们采用限制性内切酶和nested-PCR方法即可以消除假阳性和假阴性结果。

2.        转基因食品的定量检测：

l        Real-time PCR方法可以进行转基因食品的定量检测，灵敏度高，特异性高，可以检测食品中存在的很少的GMOs，操作方便，但代价高。以后还需要进一步研究其它的定量PCR方法，如竞争性定量PCR。

3.        不同食品中的DNA提取的CTAB 方法的改良：

l        我们对不同食品，尤其是食用油的DNA提取方法进行了改良。

 

 

 

Objective: Establishment of a series of qualitative and quantitative methods to detect the GMOs in different food matrix with the PCR based on DNA. Methods: Isolate the DNA of the standard samples of the Round-up Ready soybean and Bt-176 maize, which GMOs contents are known(soybean: 0%，0.1%，1%，2%; maize: 0%，0.1%，0.5%，2%) with the CTAB method, then amplify the 35S promoter and the NOS terminator inserted to modify the expression of the genes, and the house-keeping genes of the soybean and maize to detect the GMOs in food qualitatively; then detect some food samples with this method . Isolate DNA of the soybean and maize oils with the extraction kit. Detect some soybean and maize samples with the Real-time PCR quantitatively. Results: （1）The 35s promoter is 195 bp, the brightness of each lane is different because of their different GMOs contents. The GMOs negative samples also present a positive results, but the 35S promoter can be divided into two fragments of 80bp and 115bp with the XmnI restriction enzyme, the signal present in the negative samples can not be divided. The NOS terminator presents a 104bp signal with the nested-PCR. And the house-keeping gene of the soybean and the corn are Lectin gene and Invertase gene, which present 414bp and 225bp by the PCR amplification.（2）Some soybean salad oil and corn oil are detected with the PCR method, all samples but one are GMOs positive. To detect the house-keeping gene of the soybean salad oil, the nested PCR is used, and the Lectin gene presents a 118bp signal with the nested-PCR. Some kind of soybean products are also detected which are GMOs negative.（3）With the Real-time PCR, some samples which comprise soybean and corn contents are detected quantitatively, the results are compared with the results of the laboratory in U.S.A. and Singapore. Conclusions:（1）The DNA isolated with the method is suited to be amplified in the following PCR procedures, so the different DNA extraction methods in the text can be used in the GMOs detection. （2）The PCR method is sensitive to detect the GMOs in different food samples, which detection limit can be 0.1%. To the soybean and corn, the effect of detection of corn is not as good as of the soybean.（3）The Real-time PCR method is a sensitive method to detect the GMOs quantitatively with higher accuracy.