学术报告厅

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译者：王　骋 （哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨　１５０００１）
　　
围生期脂类代谢的研究模型——研究围生期营养不良的长期效应
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
  摘 要：通过对大鼠使用不同的实验设计，我们可以回答围生期脂类代谢变化造成的短期或长期影响的几个没有得到答案的问题。首先，可以说明怀孕的前半期母体脂肪蓄积的重要性，在这个关键时期胎儿的发育是缓慢的，营养不良影响脂肪库的蓄积，不但限制了子宫内的发育而且有长期的影响，如成年后的葡萄糖耐量降低。其次，哺乳期的营养不良可以产生降低体重的长期效应，即使断奶后食物的摄入恢复正常也不能改变这种效应。我们的发现也表明在怀孕期和哺乳期丰富的ｎ－３系列脂肪酸摄入会对子代的发育有不良的影响，但一些交叉的喂养试验表明这种影响的产生是由哺乳期而不是怀孕期摄入丰富的ｎ－３脂肪酸造成的。在怀孕期和哺乳期食用富含ｎ－３脂肪酸饮食的母鼠子代１０周时的血糖／胰岛素的关系发生了改变，既然富含ｎ－３系列脂肪酸的饮食会降低哺乳期母乳的分泌量，那么通过进行一些附加的的实验来确定是否减少食物的摄入或改变饮食的脂肪酸构成或者两者都改变会对葡萄糖／胰岛素中枢有长期的影响。结果：表明在哺乳期降低ｎ－３脂肪酸的饮食摄入而不是乳构成的变化在出生后１６周时会造成胰腺（葡萄糖应答）胰岛素敏感性降低。结论：目前的研究表明在怀孕早期母乳脂肪蓄积受损以及哺乳期食物的摄入而不是饮食脂肪酸的构成不同对出生后的发育和成年鼠的葡萄糖／胰岛素关系有主要的影响。
  关键词：怀孕；营养不良；大鼠；鱼油饮食；橄榄油饮食；哺乳；出生后发育；胰岛素；葡萄糖
１ 前言
  胎儿期及新生儿期生长发育的受损增加了日后成人２型糖尿病、肥胖症、心血管疾病等慢性疾病的易感性３, １５。早期营养影响生长发育，它可以使身体构成、生理、新陈代谢等发生与之适应的并且是永久的变化１４。怀孕期，胎儿可以利用的营养素是依靠透过胎盘从母体循环中获得。在考虑伦理和方法局限性的基础上，需要找到恰当的实验模型来确定母体的营养素在怀孕期和哺乳期发生了怎样的变化而导致了子代发育和成年疾病的易感性的提高。我们使用了不同的实验设计以大鼠作为实验对象来研究母体营养素在围生期的变化对脂类代谢、出生后的发育结果、改变葡萄糖／胰岛素的关系易感性的影响。
２ 母体在怀孕前半期营养不良
而导致的短期和长期影响

  怀孕时，对母体的营养观念不但应考虑母亲的饮食而且应该包括她的机体构成和新陈代谢。母体为了保证胎儿对基质的利用而改变自己的新陈代谢与之适应，在这期间脂类代谢扮演了一个重要的角色７, ８。母体组织内脂肪库的堆积是怀孕期持续的一种特征１１, １２, １９，它主要发生在妊娠的前半期，对怀孕后期的胰岛素抵抗起相反作用时，甚至可以提高脂肪组织对胰岛素的敏感性１７。母亲在怀孕早期脂肪积累能力的降低会导致甲状腺功能减退，这种减退会使怀孕后期正常的分解代谢产生特殊适应及使胎儿发育受损４, ５。因而，可以假设在怀孕早期母亲脂肪的蓄积在胎儿营养素的利用和后来的生长发育及健康上扮演了一个关键的角色。我们通过确定大鼠怀孕前半期营养不良的效应来研究这种可能性，从而来避免母亲脂肪堆积而导致子代短期及长期的效应。
  按年龄对雌性大鼠匹配进行配对，当阴道液体显微镜的涂片中出现精子时（怀孕的第０天），它们被分成两组。其中一组（对照组）自由摄食而另一组的摄食量是这一组的６０％（营养不良组）。这种喂养条件持续到怀孕后的第１２天，从怀孕初期到此时对照组的体重增加了６８．９±１．５ｇ，而营养不良组增加了１６．３±４．１ｇ（ｐ＜０．００１）。这种发现表明了营养不良的孕鼠增加脂肪的能力，既然在这个怀孕期胎儿－胎盘结构（孕体）很小１０，那么母体在怀孕早期体重的增加主要是源于脂肪的蓄积９。从怀孕的第１２天开始，不限制所有大鼠进食，两组母鼠的体重都平行的增加，到怀孕的第二十天，对照组的体重增加是１６２．６±４．８ ｇ，而营养不良组是１１３．１±４．５（ｐ＜０．００１）。因而，因怀孕早期喂养不足而导致脂肪库的蓄积受损并不因为怀孕后期喂养条件恢复正常而恢复。
  在分娩时，怀孕早期营养不良组每窝存活的新生鼠的数量及其体重都显著低于对照组，这个发现表明尽管在怀孕早期胎儿发育的较小，但是母亲在这个特殊阶段的脂肪库蓄积的受损导致了对子宫内发育的损害，这些结果在出生时都可以看到。
  在哺乳期，怀孕早期营养不良组和对照组的幼仔都由他们的妈妈分别随意喂养，我们发现到断乳时（出生后２１天）两组的幼仔都有相似的体重，这一发现指出在怀孕早期母体营养不良对子宫内胎儿的发育所造成的消极影响通过在哺乳期自由摄食而改善。
  为了确定是否母体怀孕早期营养不良对胰岛素－葡萄糖中枢产生了长期的影响，当幼仔１６个周大时，对它们进行了口服葡萄糖耐量试验，给予２ｇ葡萄糖ｋｇ体重，然后在０, ５, １０, １５, ２０, ３０, ４５, ６０ｍｉｎ收集尾部血液，然后计算６０ｍｉｎ内血浆胰岛素、葡萄糖曲线下的面积，相应的比值可以在图１中看到。我们可以清晰地看到所有幼仔在母体怀孕早期限制了食物摄入的成年雄性和雌性大鼠都出现糖耐量受损的现象，这些可以在胰岛素和葡萄糖比值曲线下面积比值的显著增加中反映出来。
  因而，目前的发现显示在怀孕前半期母体的营养不良不但对子宫内胎儿的发育有消极的影响，而且对成年后糖耐量受损有长期的影响。

图１、给怀孕期间随意进食的对照组和怀孕前半期限制饮食的营养不良组（食物的摄入在怀
孕的前１２天是对照组的６０％）的子代在１６周进行口服葡萄糖耐量试验（２ｇ糖ｋｇ），上图是血
浆胰岛素曲线下面积ＡＵＩ和葡萄糖曲线下面积（ＡＵＧ的比值，口服葡萄糖耐量试验方法
学的细节取自以前的文献１３。在营养不良组和对照组之间的统计比较：＝ｐ＜０．０５，＝ｐ＜０．００１。

３ 出生后早期营养不良的长期
影响
  既然在哺乳期的营养不良可能对发育和葡萄糖胰岛素关系产生负面的影响，那么我们也应该用一种动物模型来验证这种可能性。为了降低乳类的摄入，未经过处理的子鼠分成两窝，一窝１６只（限食组），另一窝９只（对照组）。断奶时（出生后第２１天），限食组（一窝有１６个仔鼠）的体重低于对照组（ｐ＜０．００１），表明了限食组限制了母乳的摄入。从这时不再控制所有幼仔的进食，但是在１６周时，显示哺乳期限食组体重低于对照组，这意味着限食组在断乳后恢复正常饮食体重也赶不上对照组。

在１６周时，按照上面提到的相同方法进行了口服葡萄糖耐量试验，如图２所示，在哺乳期限食组（包括雄性和雌性）胰岛素曲线下面积同葡萄糖曲线下面积的比值同非限食组相比更高。有趣的是对于子代的口服葡萄糖耐量受损程度，哺乳期限食同怀孕早期〔图１〕限食相比要小一些。
４ 调整怀孕期和哺乳期饮食中
脂肪酸构成的短期和长期效应

  基于上面的研究结果，我们要确定是否大鼠在怀孕期和哺乳期脂肪酸的摄入变化会影响子代的发育结果。因此，雌鼠从交配到哺乳期结束无限制的食用一种半合成的饮食，这种饮食中包含作为非维生素脂肪成分的１０％鱼油（ＦＯＤ）或橄榄油（ＯＯＤ），这种饮食构成如文献所述１, ２，并且在图３中也可以看到它们的脂肪酸比例， ＦＯＤ同ＯＯＤ相比，ω－３脂肪酸占较高的比例（二十碳五烯酸和二十二碳不饱和脂肪酸，ω－３的比例分别是２０∶５和２０∶６），但是十八碳烯－９－酸的比例（１８∶１）较低一些。

出生时，喂食鱼油的子代新生鼠体重低于喂食橄榄油的新生鼠（ｐ＜０．０１），在哺乳期这种差别（把每窝的幼仔数调整到８只，排除进食量的影响）得到加强，而且就像已经被指出２的喂食鱼油的幼仔体重的增加和意识反射的形成被延迟了。在图４中可以看出，喂食鱼油的母鼠的泌乳量要低于喂食橄榄油的母鼠。因而，母鼠喂食鱼油脂肪酸构成的不同和泌乳量的下降导致了子代出生后发育的延缓。
  我们还要确定是否这两组出生后发育的不同是由于母鼠在怀孕期或哺乳期饮食类型的不同而造成的。因而，设计了一个交叉喂养实验，在怀孕期喂养鱼油的子代新生儿由喂养橄榄油的母鼠喂养（ＦＯＤ－

ＯＯＤ），另一组是（ＯＯＤ－ＦＯＤ）。作为比较，我们也研究幼仔的另外两种情况，即ＯＯＤ－ＯＯＤ和ＦＯＤ－ＦＯＤ，在图５中显示了哺乳期反映意识运动反射（ａｉｒ ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｆｌｅｘ， 形态正向反射）强度的指数。我们可以看到怀孕期喂食ＦＯＤ而哺乳期喂食ＯＯＤ母鼠的仔鼠同全程喂食ＯＯＤ母鼠的仔鼠相比意识活动的反射值相同。然而，在ＦＯＤ－ＯＯＤ组和ＦＯＤ－ＦＯＤ组都观察到意识活动的反射值出现了降低。

这些发现表明哺乳期比怀孕期的饮食中脂肪酸构成不同对出生后的发育影响更大，尽管在怀孕期食物的摄入量在ＦＯＤ和ＯＯＤ两组间没有什么不同，也可能是饮食脂肪酸构成的变化和哺乳期泌乳量减少的共同效应影响了在哺乳期饮食中含ＦＯＤ母鼠的子代的发育。
５ 大鼠哺乳期饮食脂肪酸不同
构成的长期影响

  通过对上一部分发现的总结，我们决定来确定是否强化ω－３脂肪酸和哺乳期的营养不良两种因素一起对葡萄糖／胰岛素中枢有长期的影响。为了这个目的，我们把分别以ＦＯＤ和ＯＯＤ喂养的分别限制在每窝８只的幼仔从断乳起随机进食，结果发现在雄性的第７周和雌性的第１０周以ＦＯＤ喂养的母鼠的子代体重降低，并且在日后的口服葡萄糖耐量实验中血浆葡萄糖水平两组增加的程度也相似，但是以ＦＯＤ喂养母鼠的子鼠同以ＯＯＤ喂养（母鼠）的子鼠相比血糖水平增加的要少一些。因而鉴于这两组血浆葡萄糖曲线下的面积比较接近，但是以ＦＯＤ喂养的母鼠的子鼠（包括雄性和雌性）胰岛素变化的曲线下的面积显著低于以ＯＯＤ喂养（母鼠）的子鼠（ｐ＜０．０５），这表明可能存在胰岛细胞分泌受损或者胰岛素的敏感性升高或者两者都有。

   既然喂食ＦＯＤ的母鼠的泌乳量降低而引起仔鼠摄食量的降低或者母乳中增加的ω－３脂肪酸这两个因素可能导致了子代口服葡萄糖耐量实验结果的变化（从上面可以看到），那么进行了两个附加的实验来验证这两个因素的可能性。
  第１个实验，食用ＯＯＤ母鼠的幼仔（在哺乳期每窝有８个仔鼠，对照组）同食用ＦＯＤ母鼠的仔鼠（在哺乳期每窝有１６个幼仔，限食组）相比较。从图６可以看出，在断乳时，限食组的体重要显著低于对照组。从这时开始，所有的幼仔都随机食用固定配方的食物。在１６周时，哺乳期限食组（包括雄性和雌性）的体重低于对照组（统计上有显著差异）。这些哺乳期限食组（包括雄性和雌性）和对照组幼鼠的口服葡萄糖耐量实验的结果都有相似的增加，但是限食组增加的较少一些（图７），这说明摄食量的降低导致了成年后糖负荷更低的胰岛素释放。这种发现同以前的文献２１相符合，显示了大鼠（哺乳期限食） 胰腺葡萄糖应答的持续降低。

第２个实验，目的是为了确定在哺乳期总摄食量不变的前提下强化ω－３脂肪酸摄入是否对葡萄糖／胰岛素中枢有长期的影响。为此，怀孕期食用普通饮食的母鼠仔鼠被分成２组，一组（每窝有８只幼仔）由以添加１０％橄榄油（是唯一的非维生素脂肪）的半合成饮食饲喂的母鼠哺乳，另一组（每窝有４只幼仔）由除了１０％橄榄油变成１０％鱼油其他同上面相同饮食喂养的母鼠哺乳。在两组中，哺乳期高峰（１５ｄ）每窝的泌乳量都很相似，并且断乳时体重没有差别，表明两组的营养条件基本上是相同的。由表８可以看出，以ＦＯＤ喂食的母鼠同以ＯＯＤ喂食的母鼠分泌的母乳有较高的ω－３脂肪酸和较低的油酸（１８∶１），因而两组在哺乳期食物摄入相同但是饮食中脂肪酸的构成不同。从断乳开始到１６周，不限制两组幼鼠进食（食物是普通的鼠食），在１６周时两组的体重没有差别，并且两组（ＯＯＤ－８和ＦＯＤ－４）的口服糖耐量实验（２ｇｋｇ）中血浆葡萄糖和胰岛素的增加也是相似的，以上提到的比较包括所有的雄鼠和雌鼠。实际上ＯＯＤ－８和ＦＯＤ－４组的胰岛素和葡萄糖曲线下的面积的比值是相似的，即使如上文所述母鼠在围生期营养不良导致的子代葡萄糖耐量实验的变化只是暂时的和短暂的，属于成年早期（６－１２周）糖耐量的提高，到４４周时已经降低到正常，甚至到１５个月时会低于正常１６。目前的发现指出在没影响哺乳期食物摄入量的前提下，饮食脂肪酸构成的变化对体重没有短期或长期的影响，对葡萄糖／胰岛素关系也没有长期的影响。