达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：天然花色素类可以诱导多种肿瘤细胞凋亡。其主要作用机制是通过JNK信号传导通路、活化CASPases、线粒体途径、产生活性氧及阻止细胞增殖周期等多种途径实现的。
关键词：花青苷类；肿瘤；细胞凋亡
Advances in the apoptosis of tumorcell induced by anthocyanidins.ZHANG Zhuo,ZHOU Bo.
Department of Preventive Medicine，Shenyang Medical College,Shenyang 110034 China

Abstract: Researches in recent years indicated that athocyanidins induced the apoptosis of many kinds of tumor cells. In this review was introduced the mechanism of apoptosis，including JNK pathway of signal transduction，activating CASPases pathway，mitochondrial apoptosis signaling pathway，reactive oxygen species and cell cycle block pathway,etc.
Keywords: Anthocyanidin; Tumor; Apoptosis.

天然花色素是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，是植物的主要呈色物质。自然条件下游离的花色素极少见，它们常以糖苷形式存在，称之花色苷。随着科学的发展，人们发现天然花色素类物质不仅保护植物自身的健康,而且也保护着动物乃至人类的生命［1］。目前，其防癌、抗癌机制的研究已进了分子水平，表明天然花色素类物质可通过一系列途径诱导肿瘤细胞凋亡。现将有关天然花色素类物质致肿瘤细胞凋亡的文献作一综述，以了解天然花色素类致肿瘤细胞凋亡的分子机制。
1 JNK信号传导通路
cJun氨基末端激酶(cJun Nterminal Kinase，JNK)信号通路属于丝裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）通路，是细胞凋亡的主要信号转导途径之一。JNK通路的激活与细胞凋亡有密切关系［2］。JNK信号通路可被细胞外多种刺激所激活。JNK是位于胞质、分子质量为54ku的丝氨酸和（或）苏氨酸蛋白激酶。JNK能与cJun N端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化，JNK通过其氨基酸残基磷酸化而活化，一旦被激活，胞浆中的JNK移位到细胞核。活化的JNK可以和转录因子ATF2及cJun的氨基末端区域结合，使转录因子的活性区域发生磷酸化，促进基因的表达及新蛋白质的合成，新生蛋白质可能作用于细胞凋亡途径的某一环节而促进或引起细胞凋亡，对于不同的刺激因素和不同的细胞类型，作用的环节可能不同。在经飞燕草色素处理的人前髓细胞性白血病细胞实验中，JNK的磷酸化、cJun基因表达这样的JNK途径激活伴随着细胞凋亡［3］。
另外，飞燕草色素的干预也提高了细胞内活性氧物质水平。Yeh［4］等在人肝瘤细胞HepG(2) 实验中发现飞燕草色素在mRNA和蛋白水平可以分别刺激cJun和JNK磷酸化的表达。并且，飞燕草色素诱导的细胞凋亡伴随着Bax蛋白上调和Bcl2蛋白下调。可以看出花色素类诱导肿瘤细胞凋亡的过程与JNK通路密切相关。
2 CASPases途径
细胞质门冬氨酸特异性蛋白酶系(Cytosolic AspartateSpecific Proteases，CASPases)参与细胞的程序性解体，使之成为凋亡体。目前已发现的CASPases有14种之多，分别记作CASPase1～14。CASPases在胞质中以不活化的前体形式存在，大多通过蛋白裂解得以活化。CASPase8、CASPase9及CASPase3是位于凋亡通路上的3个关键因素。CASPase8对来自细胞外的凋亡诱导因子的刺激作出应答，以启动细胞解体。CASPase9对各种药物和损伤引起的刺激作出应答，启动细胞色素C从线粒体中释放，并与dATP、凋亡蛋白酶活化因子1和细胞色素C一起形成复合物，以启动细胞解体。CASPase3能放大CASPase8和CASPase9的信号，引起细胞全面自杀性解体。CASPase8和CASPase9都可以通过蛋白水解片断活化CASPase3，而CASPase3则反过来使细胞内许多重要的蛋白质(包括其余的CASPases成分)水解而得以活化。聚ADP核糖聚合酶是细胞凋亡中第一个被鉴定的由CASPase3水解的DNA修复相关酶。DNA修复功能的丧失,致使不能维系基因组的稳定，从而间接促使细胞凋亡。
Hou［5］等发现芙蓉属花色苷可以激活CASPase3、CASPase8及CASPase9而使聚ADP核糖聚合酶失活，并且导致细胞色素C释放，最终引起人前髓细胞性白血病细胞（HL60）凋亡。shih［6］用锦葵色素诱导的人胃腺癌（AGS）细胞凋亡，过程中存在凋亡小体的出现、CASPase3的激活和聚ADP核糖聚合酶水解这些形态学和生物化学上的特征。在另一项研究中，飞燕草色素诱导HL60细胞凋亡是通过JNK途径和CASPase3的激活而实现的［3］。
3 线粒体途径
线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要地点。近年来发现线粒体在细胞凋亡过程中起到了重要作用，这里既有依赖CASPases的程序化死亡途径，也存在不依赖CASPases活性的细胞死亡机制。有研究表明，几种线粒体蛋白在程序化死亡信号传导中扮演者中心角色［7］。
线粒体途径的主要机制是细胞凋亡分子细胞色素C、Smac（Diablo）、凋亡诱导因子和核酸内切酶G从线粒体的释放，然后产生级联发应使细胞凋亡。细胞线粒体细胞色素C及其它凋亡分子的释放受Bcl2蛋白家族的调控。Bcl2是一个很大的蛋白家族，分为两个亚族——抗凋亡亚族和促凋亡亚族(如Bax和Bak)。其中促凋亡亚族(Bax)是P53激活转录的产物，可以促进或诱导线粒体凋亡因子的释放从而促进凋亡。在正常情况下这些蛋白定位于细胞的非线粒体组分，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们就以线粒体作为靶细胞器而向线粒体转位，对凋亡进行调控。
Yeh［4］等在实验中发现飞燕草色素诱导人肝瘤细胞HepG（2）凋亡，并伴随着Bcl2下调和Bax上调。shih［6］在实验中发现Bax／Bcl2的比率提升到1、6倍。Bcl2主要定位于哺乳动物细胞中线粒体膜，Bcl2的下调减弱了Bcl2抗凋亡亚族的抗凋亡性，增加了凋亡的程度。同时Bax的增加与Bcl2结合并拮抗凋亡作用从而促进了凋亡的发生。由此我们推则飞燕草色素诱导细胞凋亡的机制可能是经过线粒体通路或至少与此通路紧密相关。
4 活性氧途径
活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是由外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程产生的具有很高生物活性的氧分子，细胞内ROS的产生主要是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。ROS很容易与大分子反应，可直接损伤或者通过一系列反应引起广泛生物结构的破坏。关于ROS诱导细胞亡的机制，现在认为细胞产生的氧自由基可以通过不同的途径诱导细胞的凋亡。①ROS可以直接损伤DNA而诱导细胞凋亡。②ROS可以攻击蛋白质，导致许多蛋白质尤其是具有酶活性的蛋白质功能的丧失，从而诱导凋亡。③ROS可以作用于细胞膜，诱发脂质过氧化，从而影响细胞信号传导系统，激发有关的调控基因导致细胞凋亡。④当线粒体内ROS大量产生，使其离子通透性丧失或者使线粒体膜通透性发生改变，导致线粒体膜势能发生改变，进而引起线粒体释放凋亡诱导因子等细胞凋亡因子，发生级联反应，从而诱导细胞凋亡。⑤另外，外源性或内源性ROS的大量生成也可导致细胞内氧化还原态的失衡，诱导某些基因表达，引起凋亡。
在飞燕草色素诱导HL60细胞凋亡实验中，飞燕草色素的干预可提高细胞内ROS水平。当进一步使用N乙酰L半胱氨酸和过氧化氢酶在内的抗氧化剂时，发现其能有效地阻断飞燕草素诱导的JNK磷酸化作用、caspase3激活和DNA断裂［3］。而且，花色素直接引起HL60产生细胞内过氧化氢。同样的结果也出现在芙蓉属花色苷实验中［5］。
5 阻止细胞增殖周期
细胞增殖周期可分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有丝分裂期)。细胞周期机制破坏会导致肿瘤的产生。研究表明花色素类能够作用于细胞周期的某一个环节，而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡。
有研究［8］发现飞燕草色素可以抑制子宫癌和结肠腺癌细胞的生长，使细胞聚集在细胞周期的S期，阻断了细胞从S期向G2期的过渡，并且有亚二倍体细胞和生物学特征为细胞核凝集、Annexin V染色、DNA“梯形带”的出现。这些表明飞燕草色素诱导了肿瘤细胞的凋亡。
在Chen［9］等的研究中，矢车菊色素苷或芍药色素苷可以显著抑制人乳腺癌细胞（HS578T）的生长并诱发凋亡。其机制与细胞周期G2、M阻断相关。在花色素（富含矢车菊色素和锦葵色素）诱导人单细胞白血病细胞凋亡中也出现相同的结果［10］。而在Malik［11］等的实验中发现结肠癌细胞（HT29）被阻断在细胞周期的G1和G2、M期。
6 其他途径
Chang［12］等用芙蓉属植物的花色苷诱导HL60细胞凋亡，发现这个过程是通过P38、cJun的磷酸化作用，tBid、Fas、FasL的表达和细胞色素c的释放而实现的。他们进一步使用SB203580（p38抑制剂），PD98059 (胞外信号调节蛋白激酶激活酶抑制剂)， SP600125 (JNK抑制剂)评价对HL60凋亡的影响，发现只有SB203580可以较强地抑制HL60细胞凋亡、相关蛋白表达和磷酸化作用。所以认为HAs介导的HL60凋亡是经由p38到FasL和Bid途径引起的。另外，Shih［6］等在实验中发现锦葵色素可以明显增加P38激酶的表达和抑制胞外信号调节蛋白激酶活性，并且CASPase3的激活可以分别被胞外信号调节蛋白激酶和P38的抑制剂所阻断。因此认为肿瘤细胞凋亡可能与P38有关。
最近Matchett等［13］研究发现越桔中富含的类黄酮物质（大量花色苷和原花色素）可以下调人前列腺癌细胞（DU145）中基质金属蛋白酶活性的机制。这些细胞中金属蛋白酶组织抑制因子1、2活性增加。在类黄酮物质介导的基质金属蛋白酶活性降低过程中可能有蛋白激酶C和MAPK途径参与。 但是具体的机制仍然不清楚。
综合上述，到目前为止，花色素类诱导肿瘤细胞凋亡产生的途径有如下几个特点：①诱导的细胞凋亡途径具有多样性；②一种花色素可能同时通过多个途径诱导细胞的凋亡；③花色素诱导细胞凋亡的不同途径之间存在互相交叉点；④诱导细胞凋亡发生而真正起作用的可能只是某个组分。另一方面，花色素类诱导肿瘤细胞凋亡的研究尚存在很多问题：①一些文献表明，很多花色素诱导细胞凋亡都存在剂量和（或）时间依赖性，但这种现象的机制还没有一个很好的解释；②花色素类诱导细胞凋亡过程中存在多途径和不同途径之间的交叉点，然而究竟各个途径之间如何相互作用，现在还没有真正清楚，需要深入研究；③同一种或几种花色素是否对所有肿瘤细胞都具有凋亡作用，机制是否完全相同，亦需深入研究。
总之，花色素类物质诱导肿瘤细胞凋亡机制已经在分子水平被论证了。但花色素类物质诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究现在还只是开端，期待相关内容的进一步研究。
参考文献
［1］ Gould KS. Natures Swiss Army Knife: The Diverse Protective Roles of Anthocyanins in Leaves.J Biomed Biotechnol,2004,2004(5):314-320. PMID: 15577195.
［2］ Chen YR,Tan TH.The cJun Nterminal kinase pathway and apoptotic signaling.Int J Oncol，2000，16(4):651-662. PMID: 10717232.
［3］ Hou DX,Ose T,Lin S,et al. Anthocyanidins induce apoptosis in human promyelocytic leukemia cells: structureactivity relationship and mechanisms involved.Int J Oncol,2003,23(3):705 712. PMID: 12888907.
［4］ Yeh CT,Yen GC.Induction of apoptosis by the Anthocyanidins through regulation of Bcl-2 gene and activation of cJun Nterminal kinase cascade in hepatoma cells.J Agric Food Chem,2005,53(5):1740-1749. PMID: 15740068.
［5］ Delphinidin 3sambubioside,a Hibiscus anthocyanin,induces apoptosis in human leukemia cells through reactive oxygen speciesmediated mitochondrial pathway.Arch Biochem Biophys，2005，440(1):101-109. PMID: 16018963.
［6］ Shih PH,Yeh CT,Yen GC.Effects of anthocyanidin on the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in human gastric adenocarcinoma cells.Food Chem Toxicol，2005，43(10):15571566. PMID: 15964118.
［7］ Wang X.The expanding role of mitochondria in apoptosis.Genes Dev，2001，15(22):2922-2933. PMID: 11711427.
［8］ Lazze MC,savio M, Pizzaia R. Anthocyanins induce cell cycle perturbations and apoptosis in different human cell lines.Carcinogenesis,2004,25(8):1427-1433. PMID: 15016660.
［9］ Chen PN, Chu SC, Chiou HL, et al. Cyanidin 3glucoside and peonidin 3glucoside inhibit tumor cell growth and induce apoptosis in vitro and suppress tumor growth in vivo.Nutr Cancer,2005,53(2):232-243. PMID: 16573384.
［10］ Hyun JW, Chung HS. Cyanidin and Malvidin from Oryza sativa cv. Heugjinjubyeo mediate cytotoxicity against human monocytic leukemia cells by arrest of G(2)／M phase and induction of apoptosis.J Agric Food Chem,2004,52(8):2213-2217. PMID: 15080622.
［11］ Malik M, Zhao C, et al. Anthocyaninrich extract from Aronia meloncarpa E induces a cell cycle block in colon cancer but not normal colonic cells.Nutr Cancer,2003,46(2):186196. PMID: 14690795.
［12］ Chang YC, Huang HP, Hsu JD, et al.Hibiscus anthocyanins rich extractinduced apoptotic cell death in human promyelocytic leukemia cells.Toxicol Appl Pharmacol,2005,205(3):201-212. PMID: 15922006.
［13］ Matchett MD, MacKinnon Sl, Sweeney MI, et al.Inhibition of matrix metalloproteinase activity in DU145 human prostate cancer cells by flavonoids from lowbush blueberry(Vaccinium angustifolium):possible roles for protein kinase C and mitogenactivated proteinkinasemediated events.J Nutr Biochem,2006,17(2):117-125. PMID: 16111875.