达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的研究枳实提取物的抗氧化性质。 方法采用超氧阴离子自由基、羟自由基的生成体系研究枳实提取物对自由基的清除能力及对小鼠肝、肾、心组织匀浆脂质过氧化抑制作用。结果枳实提取物具有强的自由基清除能力及抑制脂质过氧化的能力并呈现线性关系，其中枳实醇提物较水提物具有强的抑制脂质过氧化的能力。结论枳实提取物能有效清除超氧阴离子、羟自由基，抑制脂质过氧化作用，具有进一步研究和开发价值。
关键词：枳实；羟自由基；氧自由基；脂质过氧化；抗氧化

Study on the Antioxidant Activity of Citrus
Aurantium Extract in Vitro
JiaoShirong1、2HuangChengyu1SongWeiwei2
(1School of public health,Sichuan university,Chengdu 610041,China;
 2 School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039, China )

Abstract: ObjectiveAbility for antioxidative activity Citrus aurantium extract in vitro was studied. Methodthe ability of free radicals scavenging was investigated with different special chemical systems of hydroxyl radical and superoxide radicals and inhibitor lipidperoxidation with homogenates of mouse liver, kidney and heart. ResultC.aurantium extract had strong ability of free radicals scavenging and inhibitor lipidperoxidation . A linear relationship existed between free radicals scavenging and inhibitor lipidperoxidation and C.aurantium extract, especially C.aurantium ethanol extract was higher inhibitor lipidperoxidation than C.aurantium water extract. ConclusionThe extract of C.aurantium can effectively scavenge free radicaland and inhibitor lipidperoxidation significantly, which is studing in the further.
Keywords: C.aurantium L; hydroxyl radical; superoxide radicals; lipidperoxidation; antioxidative

枳实（Citrus Aurantium，ZhiShi）为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果。具有破气除痞、化痰消积的功效，是中医临床常用药物［1］。
经HPLCESMS分析，枳实中含有异柑苷、柑苷、橘皮苷、新橘皮苷、柚皮素、橙皮苷等八种类黄酮，并具有高含量［2］。研究表明柑橘类黄酮具有健康保护作用，如抑制人乳腺癌细胞、抗突变作用［3］。橘皮苷能影响血管的通透性，柚皮苷具有抗氧化作用［4］保护脂质避免过氧化［5］。
近年来，国内外开展芸香科植物，如胡柚等抗氧化性方面的研究，结果显示，有清除自由基的作用，而关于枳实的抗氧性研究未见报道。本试验在提取枳实抗氧化物质的基础上，考查枳实提取物对超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力，抑制小鼠肝、肾、心组织匀浆脂质过氧化能力，为进一步深入研究枳实的抗氧化作用奠定基础。
1材料与方法
11 材料与试剂
枳实购买自成都中药材市场（经鉴定为酸橙幼果Citrus aurantium L）；芦丁标准品：生化试剂，北京生物制品检定所；槲皮素，生化试剂，Fluka 公司；Folinciocalteuphenol reagent（福林酚试剂），Sigam公司；其余试剂均为分析纯。清洁级昆明小鼠，雄性，体重20～30g，由四川大学实验动物中心提供。
12 实验方法
121 枳实提取方法
枳实醇提物（ZhiShi ethanol extract,ZSEE）：枳实粉碎，以乙醇（70%），料液比1：30，温度80℃，提取3次，每次2h，合并滤液，60℃真空浓缩，冷冻干燥，得浅棕色粉末。
枳实水提物(ZhiShi water extract,ZSWE)：枳实粉碎，料液比1：30，温度100℃，提取3次，每次30min，合并滤液，真空浓缩，冷冻干燥，得棕色粉末。
总黄酮测定（分光光度法，芦丁为标准）［6］：取一定浓度样品，加30％的乙醇至5mL，先加5％的亚硝酸钠溶液03mL，摇匀．放置6分钟，再加10％的硝酸铝溶液03mL，摇匀，再放置6分钟，加4％的NaOH 4mL,各用蒸馏水稀释至10mL，放置15～20分钟，在波长510nm处测定吸光度（蒸馏水作空白），按回归方程计算。回归方程C=09385A-00091。相关系数 R2=09995，
公式p=C×V×m×1000〖〗W×V1×100
式中p表示总黄酮类物质含量(g／100g)，C表示从回归方程计算得样品中黄酮类物质质量(mg)，n表示稀释倍数，V表示浓缩液的体积(mL)，W表示枳实投料量(g)。
123 总多酚类物质含量的测定（福林酚比色法，没食酸子酸为标准）［6］：准确称取适量样品，用水溶解，浓度在008mg／ml左右。取1ml样品液加到10ml比色管中，依次加入去离子水1ml，福林酚试液05ml、267%Na2CO3溶液15ml，然后以水定容至10ml，室温下反应2h，在760nm处测其吸光度。按回归方程计算。回归方程C=89524A-031977。相关系数 R2=09991。
124 超氧阴离子自由基（C-2）清除能力［7］：参考文献方法，取005mol ／ L , PH82的 TrisHCl缓冲液45ml于试管中，置 25℃水浴中预热 20min，加入供试样品01ml 25mmol／L邻苯三酚04ml，混匀后在 25℃水浴中反应 4min，立即用8mmol／L的 HCL两滴终止反应，并在 299士 1nm处测定吸收度（用蒸馏水调零）。空白组以01ml蒸馏水代替样品，并按下式计算清除率：
d%=［（A空白A样品）／A空白］×100%
125 羟自由基(·OH)的清除能力：采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基（Fonton反应）方法［8］。取075mmol／L邻二氮菲溶液1mL，PBS液2mL和蒸馏水1mL，充分混匀后，加075mmol／L硫酸亚铁1mL，混匀，加001%的过氧化氢1mL，于37℃温育60min，于536nm处测其吸光度，其值为AP。用1mL30％的乙醇代替1mL过氧化氢，测得吸光度为AB。用试样1mL代替1mL蒸馏水，测得吸光度为AS。HO·自由基清除率（d%）计算公式：
d%=As-Ap〖〗AGAP×100%
126 脂质过氧化抑制作用［9］：小鼠处死后分别取肝、肾、心组织，洗净血污，剪碎用生理盐水制 3％匀浆。取此匀浆03ml加人各种试剂，反应液总体积为067ml，含不同质量浓度样品017ml , 00024%H2O2,003mmol／L FeSO401ml, 37℃保温 60min，加人1ml 20%三氯醋酸及1ml067% TBA , 90℃保温 15min后水冷，4000r／min离心 20min，取上清测定 A532nm，H2O代替TBA的平行实验管为各实验比色空白，蒸馏水代替药液的反应管为H2O管，脂质过氧化抑制率I为：I%=［（A空白A药液）／A空白］×100%。
13 统计分析
各组实验数据经SPSS115软件处理，所得数据用均数±标准差表示，用方差分析进行统计学检验。
2结果
21 枳实抗氧化物质提取与分析
抗氧化物质含量见表1。

22 枳实提取物对羟自由基的清除率
图1结果表明，枳实醇提物及枳实水提物均有羟自由基清除作用，随浓度的增加，对羟自由基的清除能力增强，并呈线性相关。

Fig1Ability for scavenging hydroxyl radical of C.aurantium extract

在同一体系中，清除自由基的能力可以用清除50%的自由基所需样品的浓度来表示，即半抑制浓度IC50表示。IC50与自由基清除剂的清除能力成反比，即IC50越小，表明清除自由基的能力越强；反之亦然。
以槲皮素为标准，从表2可知，枳实醇提物比枳实水提物对羟自由基清除能力高，但均低于槲皮素。
23 枳实提取物对超氧阴离子的清除率从图2可以得到，枳实醇提物及枳实水提物均有超氧阴离子清除作用，随浓度的增加，对超氧阴离子的清除能力增强，并呈线性相关。
以槲皮素为标准，从表3可知，枳实水提物比枳实醇提物对超氧阴离子自由基清除能力大，并与槲皮素清除作用接近。

Fig2Ability for scavenging superoxide radicals of C.aurantium extract

Fig3Ability for inhibitor lipidperoxidation of mouse live of  C.aurantium extract

241 小鼠肝组织脂质过氧化的抑制作用
从图3可以得到，枳实提取物对小鼠肝组织匀浆脂质过氧化具有抑制作用，并呈线性相关。
24 枳实提取物对脂质过氧化的抑制作用
242 小鼠肾组织脂质过氧化的抑制作用
从图4可以得到，枳实提取物对小鼠肾组织匀浆脂质过氧化具有抑制作用，并呈线性相关。

Fig4Ability for inhibitor lipidperoxidation of
mouse kidney of  C.aurantium extract

243 小鼠心组织脂质过氧化的抑制作用
从图5可以得到，枳实提取物对小鼠心组织匀浆脂质过氧化具有抑制作用，并随浓度增加抑制作用增强。

Fig5Ability for inhibitor lipidperoxidation of mouse heart of  C.aurantium extract

Fig6 50% of inhibitor lipidperoxidation of C.auIrantium extract
图6可看出枳实醇提物对小鼠肝匀浆IC50=0474mg／ml，枳实水提物IC50=13389mg／ml；枳实醇提物对小鼠肾脏匀浆IC50=1011mg／ml，枳实水提物IC50=11031mg／ml；枳实醇提物对小鼠心脏匀浆IC50=0521mg／ml，枳实水提物IC50=8355mg／ml。枳实提取物对组织匀浆脂质过氧化具有抑制作用，且枳实醇提物的抑制作用强于枳实水提物。
3讨论
研究表明，氧化损伤是导致癌症和慢性疾病的一个重要机制，对蔬菜水果包括柑橘类的摄入量高，可降低心血管疾病和患癌症的风险［10-12］，蔬菜水果中含有黄酮类物质，其具有清除自由基和降低氧化损伤带来的副作用，研究发现多酚类是一种强的抗氧化物质，黄酮类物质、花色苷等可作为抗氧化药物对心血管起保护作用［13,14］。柑橘类水果在降低局部缺血的风险中也起到一个特殊作用［15］。
我们的研究发现醇提枳实总黄酮比水提枳实高15倍，总多酚含量高25倍，同时枳实醇提物比水提物具有高的清除羟自由基和超氧阴离子的作用，提示高的总黄酮和多酚含量对羟自由基的清除起着重要作用这也与文献［15］报道一致。
枳实水提物比醇提物具有高的清除氧自由基的能力，提示水提物中可能含有Vc、多糖类等物质提高了对氧自由基的清除活性。
研究发现脂质过氧化的程度反映了机体自由基活性的高低及机体遭受自由基损伤的程度。自由基诱导的脂质过氧化反应与许多疾病的发生有密切关系，如炎症、老年性白内障、动脉粥样硬化、老年性痴呆、糖尿病并发症、衰老等。枳实醇提物和水提物均能抑制小鼠肝、肾、心组织匀浆的脂质过氧化作用，且醇提物的抑制作用高于水提物，提示枳实可能作为一种食品补充剂，降低氧化损伤带来的心血管疾病及慢性病的风险。
本试验中提取物对羟自由基和超氧阴离子的清除作用均低于槲皮素，可能是由于粗提物中的有效活性成分低于纯的槲皮素，同时和类黄酮的结构相关，需要在今后的工作中进一步对提取物进行分离和纯化和结构鉴定。
参考文献
［1］ 彭国平，牛贺明，徐丽华. 枳实活性成分的研究. 南京中医药大学学报(自然科学版)，2001（17）：91~92.
［2］ Xianguo He.,Lizhi Lian.,Longze Lin.,et al. Highperformance liquid chromatographyelectrospray mass spectrometry in phytochemical analysis of sour orange (Citrus aurantium L . ) Journal of Chromatography A,（1997）791：127-134.
［3］ Francis,A.R., Shetty,T.K., Bhattacharya,R.K. Modulating effect of plant flant flavonoids on tne mutagenicity of NmethylNnitroN nitrosoguanidine. Carcinogenesis, 1989(10):1953~1955.
［4］Chen,Y.T., Zheng,R.L., Jia,Z.J.,et al. Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Radical Biol.Med.,1990(9):19~21.
［5］Guengerich,F.P., Kim,D.M. In vitro inhibition of dihydropyridine oxidation and aflatoxin B1 activation in human liver microsomes by naringenin and the other flavonoids.Carcinogenesis,1990(11): 2275 ~2279.
［6］凌关庭主编，抗氧化食品与健康［M］.化学工业出版社，北京，2004：342~344.
［7］王巨存，邢国胜，胡文铎等.有机锗Ge132对氧自由基和由羟自由基诱导的脂质过氧化的影响.中国药学杂志［J］，1994，29（1）：2325.
［8］ 金鸣，蔡亚欣，李金荣等.邻二氮菲Fe2+氧化法检测H2O2／Fe2+.
产生的羟自由基.生物化学与生物物理学进展［J］，1996，23（6）：553-555.
［9］金鸣，李金荣，吴伟.食品红花黄色素抗氧化作用的研究.首都医科大学学报［J］，2004，25（2）：174176.
［10］ Vinson,J.A.,Dabbagh,Y.A., Serry,M.M.,et al. Plant flavonoids , especially tea flavonols,are powerful antioxidants using an in vitro oxidation model for heart disease.Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995(43):2800~2802.
［11］Wang,H.,Cao,G.,Prior,R.L. Total antioxidant capacity of fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1996(44):701~705.
［12］Joshipura,K,J.,Ascherio,A.,Manson,J.E.,et al. Fruit and vegetable intake in relation to risk of ischemic stroke.Journal of American Medical Association,1999(282):1233~1239.
［13］ Vinson,J.A.,Su,X.,Zubik,L.,et al. Phenol antioxidants quantity and quality in food :Fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001(49):5315~5321.
［14］ Wang,H.,Cao,G.,Prior,R.L. Oiygen radical absorbing capacity of anthocyanins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997(45): 304~309.
［15］ Shela,G.,Zofia,Z.,Elena,K.,et al. Comparison of the contents of the main antioxidant compounds and the antioxidant activity of white grapefruit and his new hybrid. Lebensm.Wiss.u.Technol. 2004(37): 337~34.报名表