达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的从光皮木瓜中提取多酚类物质，确定多酚类成分及含量，测定光皮木瓜多酚的抗氧化活性。方法将光皮木瓜分为水提物和醇提物部位，采用酶解方法处理原料进行对比实验，分光光度法测定其总酚、单宁和黄酮类含量；薄层色谱定性分析其单体成分；DPPH自由基清除实验测定其抗氧化性能。结果：光皮木瓜提取物总酚为1801676mg／100g鲜重，其中单宁935525mg／100g鲜重，黄酮类294523mg／100g鲜重，酶解有助于多酚含量的提高；薄层色谱做定性分析显示含有儿茶素单体和绿原酸；DPPH自由基清除实验表明水提物较醇提物活性强，酶解后各部位活性均增强。结论光皮木瓜提取物多酚类物质含量很高并有强烈抗氧化活性。
关键词：光皮木瓜；多酚；单宁；黄酮类；DPPH自由基

Polyphenol Contents and Antitoxidant Activity of
 Chaenomeles Sinesis ExtractZhang ting，Mi Mantian*，Tang yong，Zhao jing
（Institute Of Nutrition And Food Hygeine Of TMMU,Chongqing,400033,China）

Abstract: Objective the contents of polyphenol classes and antitoxidant activity in the Chaenomeles sinesis were evaluated. methodstotal polyphenols,tannins and flavonoids were determined spectrophotometrically, after extraction of plant material with aqueous and aqueous ethanol extracts, adding cellulose during processing for contrast;TLC for quantitation of single polyphenols and DPPH free radical scavenging activity test for antitoxidant evaluation of the extracts. resultsthe total polyphenols、tanins、flavoniods of Chaenomeles sinesis extracts were 1801676、935525mg／100g、294523mg／100gFW,and enzymatic process help increasing polyphenols contents；TLC showed catechin and chlorogenic acid existed;aqeous extract shows stronger DPPH free radical scavenging activity than aqeous ethanol extract,and adding cellulose could enhanced activity. conclusionpolyphenols contents in Chaenomeles sinesis extracts were high and it shows great DPPH free radical scavenging activity.
Keywords: Chaenomeles sinesis;polypheols;tannins;flavonoids;DPPH free radical

前言
木瓜为蔷薇科植物帖梗海棠［Chaenomeles speciosa（sweet）Nakai］的成熟果实，主要分为两大类：皱皮木瓜（川木瓜、云木瓜、藏木瓜、日本木瓜等）和光皮木瓜（山木瓜）,实验所用材料为光皮木瓜［Chaenomelessinesis(Touin)Koehne］属于木瓜同科植物榠楂，在我国做为传统的中药材具有祛风除湿、舒筋活络的功效［1］。研究发现光皮木瓜含有丰富的膳食纤维［2］和有机酸，特别是含有大量的酚类物质［3］和VitC，多酚包括单宁（原花青素）、黄酮类及各种酚酸等成分，是一种很有潜力的抗氧化剂，抗氧化剂无论在体内还是体外均有很强的自由基清除作用，在对癌症，心血管的治疗中具有重要作用。近年来天然的抗氧化剂特别是多酚类物质的研究比较多，葡萄多酚，苹果多酚更是研究的热点。国内外关于光皮木瓜中酚类物质和抗氧化能力的报道非常少［4］，国内仅集中于木瓜饮片中简单成份的分析。本文采用纤维素酶解的新工艺，对比了光皮木瓜水提物和醇提物以及酶解与未酶解处理原料得到提取物的多酚类物质的含量，薄层色谱分析定性其中单体类成份，并做DPPH自由基清除效应实验测定其抗氧化活性。
材料与方法
11 试验材料
光皮木瓜（chinese quince）购自綦江县打通木瓜基地。
12 试剂和仪器
主要试剂：DPPH（2,2Diphenyl1picrylhydrazyl,二苯代苦味酰肼自由基, SIGMA 公司）；FolinCiocalteu试剂（第三军医大学生化教研室试剂中心）；干酪素（分析纯）；芦丁、槲皮素、绿原酸、没食子酸、儿茶素标准品（中国药品生物制品检定所）；原花青素标准品（天津尖峰天然产物有限公司）；其余试剂为分析纯。
主要设备；聚酰胺薄层板；紫外分光光度计（北京普析通用设备有限公司）。
13 实验方法
131 原料提取
7月份新鲜采集光皮木瓜洗净，去核、切丁，称取两份相同重量的木瓜分别加水打浆，得匀浆，向其中一份匀浆加入1%纤维素酶，放入摇床中震摇酶解（45°，30min），将酶解和未酶解的匀浆冷冻离心，得上清液水提物（CS和CEs）和沉淀，将沉淀用一定浓度有机溶剂回流提取一定时间，过滤得醇提物（Cr和CEr）。
132 提取溶剂的确定
分别用50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇、无水甲醇和无水丙酮作为溶剂按照以上工艺提取一次，过滤得滤液，定容至100ml得待测液。用FolinCiocalteu法测定测定滤液中总酚含量。
133 提取次数的确定
称取5g沉淀，量取25ml50％乙醇溶液，混合，85℃回流提取1h；
过滤，无水乙醇定容至100ml（S）；
量取25ml95％乙醇溶液，与残渣混合，85℃回流提取1h；
过滤，合并两次滤液，无水乙醇定容至100ml(D)；
量取25ml95％乙醇溶液，与残渣混合，85℃回流提取1h；
过滤，合并三次滤液，无水无水乙醇定容至100ml(T)。
单次提取按照步骤1-2，两次提取按照步骤1-4，三次提取按照步骤1-6。在第一次提取过程中，大部分的多酚类物质被提取，因此，在第二次和第三次提取是采用了更强极性的溶剂（95％乙醇）。得三种滤液S、D、T。用无水乙醇分别定容三种滤液至100ml，隔夜，过滤，去沉淀，得滤液用FolinCiocalteu法测定测定滤液中总酚含量。
134 总酚的测定
总酚含量的测定采用FolinCiocalteu法［5］并稍做改良。精密称取没食子酸30mg，溶于100ml无水乙醇中，制成03mg／ml的没食子酸标准溶液。分别吸取此溶液0，01，02，04，06，08，10ml（相当于没食子酸0，30，60，120，180，240，300ug）于45ml具塞离心管中，蒸馏水定容至10ml处，加入05mlFolinCiocalteu试剂，75％无水碳酸钠溶液定容至20ml，放置30min，于765nm处测定吸光值。
分别吸取待测样品溶液CS、CES、Cr、CEr 01ml于45ml具塞离心管中，蒸馏水定容至10ml处，以后步骤同标准曲线的制备。以mg没食子酸当量（GAE）／100g鲜果重示多酚含量。实验均为三重复。
135 单宁的测定［6］
用干酪素振摇吸附单宁后，采用FolinCiocalteu法测定单宁含量。分别吸取01ml待测样品CS、CES、Cr、CEr于15ml离心管中，加水定容至10ml后倾入100ml三角瓶中，加入精密称取的100mg干酪素，混匀，放入摇床中振摇后（150r／min，45min），拿出过滤，得滤液照所述方法测定未被吸被吸附的酚类物质含量，用总酚含量减去干酪素吸附单宁后测得酚类含量即可得到单宁含量。以mg没食子酸当量（GAE）／100g鲜果重示单宁含量。实验均为三重复。
136 黄酮类的测定
黄酮类含量的测定采用中国药典2000年版一部附录VB并稍做改良。精密称取芦丁20mg，溶于100ml无水乙醇中，制成02mg／ml的芦丁标准溶液。分别吸取标准溶液0、01、02、04、06、08、10ml（相当于芦丁0、20、40、80、120、160、200ug）于25ml容量瓶中，蒸馏水定容至6ml处，加入5%亚硝酸钠1ml，摇匀，放置6min，加入10％硝酸铝1ml，摇匀，放置6min，随后加入4%氢氧化钠10ml，加水至刻度25ml，摇匀，放置15min后，于500nm处测定吸光值。
分别吸取待测样品溶液CS、CES、Cr、CEr 01ml于45ml具塞离心管中，蒸馏水定容至6ml处，
以后步骤同标准曲线的制备。以mg芦丁／100g鲜果重示黄酮类含量。实验均为三重复。
137 多酚TLC定性分析
用毛细管定量5μl吸取标准对照品没食子酸、绿原酸、儿茶素、芦丁、槲皮素、原花青素和样品CS、CES、Cr、CEr顺序从左至右点于两块聚酰胺薄层层析板（10×20cm）上，分别放入层析缸中用展开剂甲苯－丙酮－甲酸（3:3:1）［7］展开，展开后分别用铁氰化钾三氯化铁还原试剂和1%三氯化铝乙醇喷板显色，后者在紫外灯下观察；定量吸取对照品绿原酸、样品CS、CES、Cr、CEr顺序从左至右点于聚酰胺薄层层析板（10×10cm）上，放入层析缸中用展开剂36％已酸展开，展开后用铁氰化钾三氯化铁还原试剂喷板显色。
138 DPPH自由基清除试验
1381 样品处理
分别吸取样品溶液CS、CES、Cr、CEr01ml于1ml离心管中，蒸馏水定容至1ml，移取此溶液50、100、150、200、250μl于1ml离心管中，蒸馏水定容至1ml，制成不同浓度待测液。
1382 DPPH自由基清除率的测定
准确称取25mgDPPH，用无水乙醇溶解并定容于50ml，制成浓度为05mg／ml的DPPH溶液，量取此溶液24ml，用无水乙醇定容至100ml，制成浓度为012mg／ml的DPPH溶液。吸取2ml012mg／ml的DPPH溶液于05ml具塞离心管中，加入09mlTrisHcl（50Mm,PH74），02ml待测液，摇匀，以无水乙醇为参比于515nm处测定吸光值Ai。同时以02ml无水乙醇代替待测液做空白对照，测定吸光值Af。
根据以下公式计算清除率：
DPPH（％）＝（1－Ai／Af）×100%
式中，Ai为未加待测液时DPPH溶液的吸光值；
Af为加入待测液时DPPH溶液的吸光值；
1383 IC50的测定
IC50定义为DPPH清除率为50%时所需抗氧化剂浓度，根据不同浓度抗氧化剂的清除率作曲线得出。
2 结果与讨论
21 提取溶剂的确定
Fig1显示，50％乙醇提取多酚的溶液用FolinCiocalteu试剂显色后具有最大吸光值，因此选用50%乙醇做为提取光皮木瓜多酚的溶剂。
22 提取次数的确定
Fig2显示，对沉淀部分进行二次提取后溶液的吸光值高于一次提取，有必要对对沉淀部分进行二次提取，但三次提物后溶液吸光值于二次相差不明显，说明三次提取对总酚量贡献不大，考虑到成本等因素，对沉淀进行两次提取即可。
23 酶解对总酚的影响
纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称，它们协同作用分解纤维素，半纤维素，促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来，并能将大分子多糖、蛋白质降解成小分子物质，减少对多酚类物质提取的影响。从表中可以看出，未加纤维素酶处理的光皮木瓜水提物中多酚含量为529123mg／100g，醇提物中多酚含量为857473mg／100g，而加入1％纤维素酶后，水提物中多酚含量为586505mg／100g，醇提物中多酚含量为1215171mg／100g，分别提高了1084％和4172％，总酚提取提高了2994％，说明采用酶解的方法对醇提物的影响较水提物大，总的来说，酶解方法能够显著提高多酚的提取率。

24 多酚、单宁和黄酮类含量
本研究发现光皮木瓜中多酚含量很高，其中木瓜汁（水提物）中总酚含量为586505mg／100g，高于文献报道的此品种木瓜（chaenomeles）中酚类化合物含量为185～476mg／100g，可能与选用的木瓜品种和成熟度有关；国外学者仅研究了木瓜汁中多酚类物质含量［3］，但未有对榨汁后的木瓜残渣中多酚测定的报道，本研究发现发现木瓜榨汁后的残渣（醇提物）中含有大量的多酚类物质，为1215171mg／100g，远远高于木瓜汁中多酚含量。据报道苹果中多酚含量为298mg／100g、葡萄490mg／100g，黑醋梨1200mg／100g、黑莓300mg／100g、桑果420mg／100g、博以森树莓440mg／100g、香蕉瓜450mg／100g、黑加仑620mg／100g，接骨木果990mg／100g，而按照此提取工艺所测得光皮木瓜中总酚含量应为水提物和醇提物中多酚含量之和1801676mg／100g鲜重，明显高于上述所有水果总酚量。
单宁具有沉淀蛋白质的能力，利用干酪素吸附单宁可得知定单宁含量［7］。光皮木瓜水提物中单宁含量为217125mg／100g鲜重，约占总酚含量的3702％，醇提物中为单宁含量为718400mg／100g鲜重，约占总酚含量的5912％，高于水提物中单宁含量，而总的单宁含量为935525mg／100g鲜重，约占总酚含量的5193％，这与日本学者［7］的研究结果光皮木瓜中含有大量的原花青素结果一致；对黄酮类的测定结果显示，光皮木瓜水提物中黄酮类含量为294523mg／100g鲜重，醇提物中为289077mg／100g鲜重，分别占总酚的5022％和2379％，总黄酮为5836mg／100g鲜重，占总酚含量的3239％，关于光皮木瓜中黄酮类的物质的测定国外鲜有报道，仅国内学者有过研究［8］

24 TLC分析
喷铁氰化钾三氯化铁还原试剂后薄层显色为蓝色斑点，由fig3可看出，水提物、醇提物以及葡萄籽原花青素成份较为相似，均有展开剂不能展开的成份停留在基线显示出强烈的蓝色斑点，此为大分子的鞣质类成份［7］，与d位置对比初步判断光皮木瓜提取物中有儿茶素类存在，为此我们喷以1%三氯化铝显色后观察斑点位置和颜色，发现展开的水提物、醇提物及葡萄籽原花青素展开斑点与d、f、g在紫外灯下贯彻均显示出黄色荧光，说明有黄酮类物质的存在，为黄烷醇类的儿茶素；fig4中停留在基线的为大分子鞣质，随展开剂的展开呈现出叠加的蓝色斑点为不同聚合程度的原花青素［7］，与e对照可知样品中存在绿原酸，但就显色强度和斑点大小来看，水提物中绿原酸含量高于醇提物。

25 DPPH清除效应
251 DPPH体系稳定性
测定2mlDPPH在无水乙醇介质中AU与时间的关系。结果显示DPPH的吸光值在1h内，基本不变。因此所有样品在1h内测定完毕是可靠的。
252 DPPH清除效应与多酚
从表可以看出，水提物的IC50(分别为0054mg／ml、0042mg／ml）小于醇提物的IC50（分别为0057mg／ml、0055mg／ml）；而酶解后的木瓜提取物IC50小于未处理组。说明木瓜水提物的DPPH清除率大于醇提物，经酶解后的木瓜提取物的DPPH清除率大于未经酶解的木瓜提取物（fig2），以上结果与木瓜的总酚含量关系一致，木瓜水提物的总酚含量大于醇提物，酶解后的木瓜提取物总酚含量有所提高。说明酚类物质的含量与木瓜的抗氧化活性成正比。

参考文献
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