达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的观察紫菜多糖对正常小鼠免疫功能的影响。方法分别经口给予实验小鼠500、1000、2000mg／kg BW三个剂量的紫菜多糖。30天后，测定小鼠脏器／体重比值、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能、NK细胞活性和白介素-2的值。结果各剂量组对小鼠胸腺／体重比值、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力、小鼠NK细胞活力和小鼠血清溶血素水平均无影响；500和2000mg／kg BW剂量组能升高小鼠脾／体重比值；2000mg／kg BW剂量组的紫菜多糖能明显增强DNFB诱导的小鼠迟发型变态反应、增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力、能促进抗体生成细胞的生成，并能促进体液细胞白介素2数值的增加；1000、2000mg／kg BW剂量组使碳廓清能力增强。结论紫菜多糖具有增强小鼠免疫功能作用。
关键词：紫菜多糖；免疫调节

The Study of Porphyra Polysaccharide Sulfate(PPS) on
Regulating the Immune Function in Mice
Zhang Xunjie1，3Chen Guanmin2Chen lun2
1Fujian Hwanan women college, Fuzhou 350007
2Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350004
3Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002

Abstract: ObjectiveTo observe the immune regulating effect of PPS in normal mice. MethodsThe mice were feed with PPS respectively at different concentration 500,1000 and 2000 mg／kg.d for 30 days. Mouse internal organs／body weight ratio, cellular immunity function, body fluid immunity function, single nucleus macrophage function, NK cell activeness and Bai Jiesu -2 value were detected. ResultsThere were no remarkably effects in mouse chest gland／body weight ratio, phagocytic function of peritomeal macrophage, NK cell activeness, andhemolysin production level. PPS can induce mouse spleen gland／body weight ratio at low and high dose. PPS can also promote DTH induced by DNFB, increase hemolysin production，enhance interferon2 （IL-2）and antibody formation cell production at high dose. PPS improve carbongranular clearance ability effectively at 1000、2000 mg／kg BW dose. ConclusionPPS( Porphyra polysaccharide sulfate) can enhance the immune function in mice.
Keywords: Porphyra polysaccharide sulfate (PPS); immunologicregulation.

我国海洋资源丰富，海藻品种繁多，为人们提供了食用、药用和工业利用等多种产品。紫菜（Porphyra）是一种营养价值较高的海藻，属红藻门(Rhodophyta)，红毛菜科(Bangiacea)。海藻多糖物质具有广谱的免疫调节活性，并能通过免疫调节作用发挥多种生理活性［1］。紫菜多糖（Porphyra polysaccharide sulfate，PPS）是一种聚半乳糖的硫酸酯多糖［2］，是在糖羟基上带有硫酸基的水溶性多糖，本文将重点探讨紫菜多糖的免疫调节作用，合理地开发我国紫菜的商业价值，使之获得良好的经济、社会效益。
1 材料和方法
11 原料及试剂
紫菜为福建省连江市制碘厂提供的干燥坛紫菜。试剂为分析纯或化学纯。
12 紫菜多糖的制备
121 紫菜多糖样品提取工艺流程
干燥紫菜→ 粉碎 → 浸泡 （ 除去色素和小分子物质）→组织匀浆→热水提取→过滤→ 乙醇沉淀→除蛋白质→浓缩→冻干（得粗多糖）→纯化→ 紫菜多糖样品
122 预处理
取经烘干、粉碎后的紫菜20g，置于250mL烧杯中；加20ml 60%丙酮浸泡、搅拌、静置、抽真空过滤、弃去滤液；再用丙酮重复处理一次；用40ml95%乙醇回流1h，过滤，弃去滤液；用40ml无水乙醇回流提取半小时，过滤，弃去滤液；先用乙醇，再用丙酮，然后用乙醚洗涤，过滤，在空气中干燥。这一过程可除去紫菜中的脂溶性组分。
123 提取
将预处理的紫菜，用蒸馏水浸泡、搅拌，静置过夜，再经组织捣碎；在80℃水浴浸提2h，离心，上清液抽滤，用旋转薄膜蒸发器浓缩至适当体积，得紫菜多糖粗提液。用酒精使多糖脱水沉淀，静置、离心，然后依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，用P2O5真空干燥，得灰白色纤维状的紫菜多糖粗品。
13 实验动物
实验动物由中科院上海实验动物中心提供的清洁级BALB／c雌性小鼠，共200只，体重为18～21 g，合格证号为sCXK(沪)2003—003。动物按体重随机分成6大组,每大组再分成4组(20个小组)，分别为①体液免疫组：进行溶血素、空斑测定；②细胞免疫组：进行DTH试验；③NK细胞活性组；④⑤单核- 巨噬细胞及脏体比组：进行小鼠碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验及脏体指数测定；⑥白介素2组。
14 剂量选择
试验设紫菜多糖低、中、高剂量组，分别为500、1000、2000mg／kg BW三个剂量组及蒸馏水对照组。
15 给予受试物途径
动物按动物按20ml／(kg BWd)连续灌胃30天，试验期间，每周记录动物体重一次,分别进行相关指标的测试。
16 仪器与试剂
161 仪器8mm直径打孔器、微量血凝试验板、UniverSal-32R台式中低速离心机、MODEL680酶标仪、96孔培养板、Co－150CO2培养箱、200目筛网、722光栅分光光度计、Olympus IX71倒置显微镜、SRBC、鸡红细胞、Y -1细胞等。BonsoTes-2000A电子天平等。
162 试剂注射用印度墨汁、刀豆蛋白A(ConA)、MTT、DNFB、丙酮、麻油、SRBC、生理盐水、鸡红细胞、羊红细胞、甲醇、Giemsa染液、YAC-1细胞、Hanks液(PH72～74)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、TrisHC1缓冲液(PH82)、1％NP40、台酚兰、1mol／L盐酸、酸性异丙醇等。
17 方法
171 小鼠脏器／体重比值(胸腺指数和脾指数)取小鼠40只，随机分成4组，连续灌胃30d后，小鼠称重，颈椎脱臼处死小鼠，取出脾脏及胸腺，用滤纸吸干血迹后称重。
172 细胞免疫功能
1721 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法) 无菌取脾制成单细胞悬液，每份细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μlConA液，另一孔为对照，置培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸去上清液07ml，加入07ml不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT 50μl／孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板，每孔做3个平行孔，用酶标仪以570nm波长测定光密度值。
1722 迟发型变态反应(DTH)检测小鼠腹部皮肤用电动剃毛刀进行脱毛处理，后用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏；5d后，再用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳两面进行攻击；24h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右两耳，用打孔器取下直径8mm的耳片称重，计算左右耳重量差值。
173 体液免疫功能小鼠腹腔注射2％(v／v)SRBC悬液02ml进行免疫。5d后，取小鼠眼球血做血清溶血素检测，并将动物颈椎脱臼处死，取脾脏进行抗体生成细胞检测。
1731 抗体生成细胞检测取出脾脏后，将脾细胞悬浮于8ml Hanks液中。将表层培养基加热溶解后，放入45℃水浴保温，与等量的PH72～74、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管05ml，再向管内加入50μl 10％SRBC、25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂薄层的6cm平皿上，放入CO2培养箱中温育15 h，然后用SA缓冲液稀释的补体加入，继续温育15h后，计数溶血空斑数。
1732 血清溶血素测定(血凝法)将小鼠眼球血于2000 r／min离心10min分离血清，用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μl，再加入100μl05％(v／v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度(用抗体积数表示)。
174 单核－巨噬细胞功能测定
1741 小鼠碳廓清实验测定按10ml／kg从小鼠尾部静脉注入稀释的印度墨汁，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml 01％Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作为空白对照。将小鼠处死后解剖动物，取出肝脏、脾脏，用滤纸吸干血迹后称重，计算吞噬指数a［吞噬指数a=体重／(肝重+脾重)×k1／3；k=(OD1—OD2)／(t2—t1)］。
1742 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml。间隔30min，处死动物，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，移置37℃孵箱温育30min，用4％(v／v)Giemsa—磷酸缓冲液染色3min后计数，计算吞噬百分率［吞噬百分率(％)=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／计数的巨噬细胞数×100］和吞噬指数［吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数／计数的巨噬细胞数］。
175  NK细胞活性测定(LDH测定法)无菌取脾制成单细胞悬液，试验前24h将靶细胞传代培养。取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比为50∶1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μl，上述各项均设三个平行孔，于37℃ 、5％CO2培养箱中培养4h，然后将培养板离心(1500r／min)5min，每孔吸取上清液100μl置于96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol／L的Hcl30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)，计算NK细胞活性［NK细胞活性(％)=(反应孔OD—自然释放孔OD)／(最大释放孔OD—自然释放孔OD)×100］。
176  白介素2测定 采用双抗夹心ELISA法，用试剂盒测定吸光度OD值。
18 实验数据统计方法实验数据以SPSS软件进行单因素方差分析。
2结果
21 紫菜多糖对正常小鼠脏器／体重比值的影响与对照组相比，紫菜多糖各剂量组脾重／体重比值差异有统计学意义，低剂量和高剂量组与对照组相比有显著差异（P＜0001）。与对照组相比，中剂量组1000mg／kg BW胸腺／体重比值上升差异无统计学意义（P＞005）。结果见表1。胸腺指数各剂量组与对照组相比虽无统计学意义，但结果呈剂量关系。

22 紫菜多糖对正常小鼠细胞免疫功能的影响

221 紫菜多糖对ConA诱导的正常小鼠脾淋巴细胞转化的影响紫菜多糖的高剂量组，2000mg／kg BW 剂量组的淋巴细胞增殖能力高于对照组，差异有统计学意义(P＜001)，并且有剂量效应关系。结果见表2。
222 紫菜多糖对正常小鼠迟发型变态反应水平(DTH)的影响紫菜多糖的2000mg／kg BW剂量组对小鼠迟发型变态反应水平高于对照组，差异有统计学意义(P＜005)，并且有剂量效应关系。结果见表2。

23 紫菜多糖对正常小鼠体液免疫功能的
影响231 紫菜多糖对正常小鼠抗体生成细胞的影响紫菜多糖的低、中、高剂量组对小鼠抗体生成细胞的生成作用呈剂量-效应关系。高剂量组与对照组相比，差异有统计学意义(P＜001)，各剂量组对血清溶血素的影响，与对照组相比虽无统计学意义，结果见表3。

24 紫菜多糖对正常小鼠单核－巨噬细胞
功能的影响241紫菜多糖对正常小鼠碳廓清的影响与对照组相比，紫菜多糖各剂量组对小鼠碳廓清能力有显著差异，呈剂量效应关系，有统计学意义,高剂量组和中剂量组与对照组相比有显著差异(P＜0001,P＜001)。结果见表4。
242 紫菜多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响与对照组相比，紫菜多糖各剂量组对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的增强,差异无统计学意义(P＞005)。结果见表4。

25 紫菜多糖对正常小鼠NK细胞活性的
影响紫菜多糖的各剂量组小鼠NK细胞活性与对照组的差异无统计学意义(P＞005)。结果见表5。
26 紫菜多糖对正常小鼠白介素2的影响
紫菜多糖的高剂量组,2000mg／kg BW对小鼠白介素2的OD值与对照组的差异有统计学意义(P＜001)。结果见表6。

3 讨论
根据实验结果，紫菜多糖2000mg／kg BW剂量组能明显增强DNFB诱导的小鼠迟发变态型反应，且呈剂量效应关系；紫菜多糖的低、中、高剂量组对小鼠抗体生成细胞的生成作用呈剂量效应关系。2000mg／kg BW剂量组能明显促进抗体生成，及提高小鼠脾重／体重比值；2000mg／kg BW剂量组能使ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力明显增强；1000、2000mg／kg BW剂量组使碳廓清能力增强；紫菜多糖的高剂量组,2000mg／kg BW使小鼠白介素2的含量显著提高，说明紫菜多糖（PPS）对小鼠的细胞免疫、体液免疫均有增强作用。
多糖类化合物是构成生物体的一类十分重要的有机结构成分。是生命的物质基础。多糖的种类各异。在生物体中行使着不同的功能。主要影响机体的网状内上皮系统和蛋白质的合成及抗体的生成，含有激活淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，具有促进细胞因子的生成，改善机体的免疫功能的作用［3-4］ 。闫建忠等探讨紫菜多糖对免疫功能低下小鼠的保护作用，利用小鼠腹腔注射不同剂量的紫菜多糖，发现紫菜多糖组小鼠的NK细胞毒活性、脾细胞分泌IFNγ及NO的水平均高于对照组，表明紫菜多糖具有免疫功能增强的作用［5］。同样是闫建忠的另外一篇文献报道：不含有3，6－内醚－半乳糖的硫酸基紫菜多糖不具有脾脏淋巴细胞、胸腺淋巴细胞以及混合淋巴细胞的增殖作用，提示：紫菜多糖中起到免疫调节作用可能与3，6－内醚－半乳糖硫酸基有关［6］。张伟云等采用细胞培养技术测定从条斑紫菜中得到的多糖PY3对小鼠免疫细胞及人肿瘤细胞K562生长的影响。结果表明。紫菜多糖PY3对小鼠骨髓细胞和脾脏淋巴细胞、巨噬细胞的增殖以及对混合淋巴细胞反应均有促进作用［7］。紫菜多糖的抑制癌症的作用，与增强巨噬细胞的细胞毒活性有关，巨噬细胞表面有不同紫菜多糖分子受体，从而激化了巨噬细胞等免疫细胞。
结合上述实验结果，可以推测紫菜多糖是通过3，6－内醚－半乳糖硫酸基，或者调控免疫细胞的产生和活力等方式在人体内发挥免疫协同作用，使其达到显著的增强免疫作用。医学研究表明：机体组织细胞的凋亡、疾病的发生或多或少都与机体免疫系统的结构组成和免疫功能有关，如果正常机体的免疫系统不能对细胞的凋亡进行调控，相应的组织器官就会发生病变，如肿瘤、艾滋病和乙肝等疾病也均为免疫系统受累导致免疫功能低下所致。所以，通过提高患者免疫功能来增强机体抗病力的治疗方法受到了前所未有的关注。
本次研究已表明，紫菜多糖具有增强免疫调节的作用，可以针对不同人群开发出相应的产品。对于免疫缺陷疾病患者可以作为辅助用药，达到增强机体抗病能力以及愈后康复程度，缩短治疗时长的目的；对于免疫低下人群可以提高机体免疫力，预防和消除因免疫功能低下引起的各种疾病。另外，可以通过制剂学方向的研究，研究各种剂型，达到提高产品的人体生物利用度，增强其免疫调节的疗效。
参考文献
［1］ 王阳,王伯初, 周箐等. 多糖的免疫调节功能研究进展.重庆大学学报,2004,27 (3):104-107.
［2］ 金骏,林美娇. 海藻利用与加工.科学出版社,1993.
［3］ 李丽，王乃平. 植物多糖的药理作用研究纂要［J］. 中医药学刊，2004，22(10).
［4］ 瞿少钦. 生物多糖的免疫作用的研究进展及应用［J］. 中国兽医药杂志，2001，104(3):2.
［5］ 闫建忠, 吕昌龙, 李胜军等. 紫菜多糖的免疫功能增强作用., 2005，24（4）:36-38.
［6］ 闫建忠, 吕昌龙, 李胜军等. 一种紫菜多糖的制备及对淋巴细胞生长的影响. 汉植物学研究，2001，19（2）:149-152.
［7］ 张伟云，周建峰，陈 颢等. 紫菜多糖对免疫细胞及肿瘤细胞生长的影响. 生命科学研究. 2002,6(2):167-169.