达能营养中心第九届学术研讨会论文集

摘要：目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T位点多态性与高脂血症的关系。方法选取北京市海淀区122名高脂血症患者和90名血脂正常者分别作为病例组和对照组。对两组人群均进行血脂谱主要指标测定，并采用PCR-RFLP方法进行MTHFR基因C677T位点多态性检测。结果高脂血症组和正常对照组T等位基因频率分别为054和038，差异有显著性（P＜005）。CC、CT、TT三种基因型分布在两组间的差异亦有显著性（P＜005）。按血清TC和TG水平将高脂血症分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症和混合型高脂血症三个亚组后发现高胆固醇血症组与对照组基因型分布和等位基因频率仍具有显著性差异(P＜005)。结论提示MTHFR基因C677T位点多态性可能与高胆固醇血症相关，T等位基因可能是高胆固醇血症的危险因素。
关键词：亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；高脂血症

Relations between polymorphism of Methylenetetrahydrofolate
reductase gene polymorphism and hyperlipidemiaHuang LeiSong XiaomingZhu WenliLi Yong
Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Peking University, Beijing 100083, China

Abstract : Objective To investigate the relationship between this polymorphism and serum lipid levels in hyperlipidemic and normolipidemic individuals Methods A total of 122 unrelated hyperlipidemic individuals and 90 unrelated normolipidemic individuals were selected from Hai Dian District of Beijing For the two groups of subjects ,the serum lipids profiles were measured and the C677T polymorphism was analyzed (PCR RFLP)  ResultsThe frequencies of C allele in hyperlipidemic and control groups were 054 and 038 , respectively There was significant difference in genotype frequencies or allele frequencies of this polymorphism between hyperlipidemic and control groups When the hyperlipidemic subjects were divided into three subgroups (hypertriglyceridemic, hypercholesterolemic ,combined hyperlipidemic) according to lipid levels , there was still significant difference in genotype frequencies and allele frequencies of this polymorphism between hypercholesterolemic subgroup and control group ConclusionThe study indicated that C677T genotypes were possibly related with hypercholesterolemic subjects , T allele may be a new risk factor for hypercholesterolemia
Keywords: Methylenetetrahydrofolate reductase gene;Gene polymorphism; Hyperlipidemia

近年来大量的临床及流行病学资料表明，高同型半胱氨酸血症是导致动脉粥样硬化等心脑血管疾病的一个重要的危险因素。目前认为同型半胱氨酸（Homocysteine,Hcy）主要通过促进血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、脂质过氧化和血液凝固性增高等机制来诱导动脉粥样硬化的发生［1］。上述机制在心脑血管疾病中的作用以及是否还有其它机制尚需要进一步的研究。然而，目前国内尚未见有关Hcy代谢关键酶与血脂水平关系的研究报道。为此，我们检测了122名高脂血症患者和90名健康人, 研究亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase ，MTHFR ）基因多态性与高脂血症的相关性, 为探索Hcy致动脉粥样硬化机理提供依据。
1 对象与方法
11 研究对象经北京大学医学伦理委员会批准，在北京市海淀区花园路社区遵循自愿原则选取高脂血症患者122例(总胆固醇TC≥572mmol／Ｌ或甘油三酯TG≥170ｍmol／Ｌ)，平均年龄为578±774岁，其中男性70人，女性52人。另选取正常血脂组90例(TC＜520mmol／L且TG＜170mmol／L)，平均年龄为561±893岁，男性57人，女性33人。排除有严重急慢性疾患如冠心病、脑卒中、糖尿病、肾功能不全及长期服用影响脂质代谢药者。
12 血脂谱主要指标检测采集清晨静脉血5ml，取血清进行血脂谱主要指标测定。血脂谱主要指标包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)。所用仪器为荷兰VITALAB2型全自动生化分析仪，用质控血清进行质量控制。
13 MTHFR基因C677T＞Ｃ位点多态性分析用酚－氯仿抽提法从血凝块中提取基因组DNA。PCR 反应所用的引物序列［2］，正义5′TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA 3′，反义5’AGGACGGTGCGGTGAGAGTG3′。PCR 反应体系(20μl )：051μg 基因组DNA、20μl 10×PCR反应缓冲液，12ul 25mmol／LMgcl2、05μl10 mmo l／L dNTP、01μl 50 mmo l／L 的引物、024μl 5U／μl Taq DNA 聚合酶。PCR 循环参数: 94℃ 30 s，62℃ 45s，72℃ 50 s，循环30周后于72℃延伸10 m in。循环条件: 预变性94 ℃2min、变性94 ℃30s、复性62 ℃30 s、延伸72 ℃45s ，循环30 次后72 ℃延伸7min。2 %琼脂糖凝胶电泳观察PCR 产物。取PCR 产物10μl， 加10×Buffer 20μl， 02μl 20U／μl Hinf I 酶，20μl 1mg／ml BSA ，补水至20μl ，37℃消化4h ，25%琼脂糖胶电泳观察结果。
14 资料整理与分析使用SPSS for windows110 统计软件包进行数据分析。各组基因型分布差异用χ2检验，不同基因型之间血脂水平的比较用ｔ检验。
2 实验结果
21 高脂血症组与对照组的临床资料分析将高脂血症组与对照组的临床资料对比分析，结果见表1。高脂血症组TC、TG、HDLC和LDLC显著高于对照组（P＜005），而性别构成两组之间差异无显著性。

22 病例组与对照组父母MTHFR基因型分布及等位基因频率比较MTHFR基因扩增目的片断大小为198bp，根据HinfⅠ酶切片断的情况MTHFR有3种基因型，即野生型CC，不被酶切，含有198bp１种片段，纯合突变型TT，被酶切成175bp和23bp2种片段，杂合突变型TC，一条DNA被酶切，另一条未被酶切，含有198bp、175bp和23bp3种片段。高脂血症组与对照组基因型和等位基因频率分析，见表2。高脂血症组基因型分布符合HardyWeinberg平衡规律（χ2 ＝0004，P＞005）。正常对照组基因型分布亦符合HardyWeinberg平衡规律（χ2 ＝0269，P＞005）。两组基因型分布差异具有显著性（χ2 ＝10386，P＜005）。高脂血症组C等位基因的频率为046，T等位基因频率为054，与正常对照组相比差异亦有显著性（χ2 ＝10529，P＜005)。与CC基因型相比，CC／CT基因型个体患高脂血症的OR值为2462，95%可信区间为(1345，4506)。

23 不同类型高脂血症与对照组基因型分布和等位基因频率比较按TC和TG水平将高脂血症分为高胆固醇血症(TC≥572mmol／L且TG＜170mmol／L)、高甘油三酯血症(TC＜572mmol／L且TG≥170mmol／L)和混合型高脂血症(TC≥572 mmol／L且TG≥170mmol／l)，分别比较不同类型高脂血症与对照组基因型分布的差异，见表3。高胆固醇血症组基因型分布和等位基因频率与对照组相比具有显著性差异（P＜005）；与CC基因型相比，CT／TT基因型患高胆固醇血症的OR值为4400，95％可信区间为（1570，12335）。而另外两组与对照组相比，基因型分布和等位基因频率都无显著性差异（P＞005）。

24 不同类型高脂血症组和对照组不同基因型间血脂水平的比较高胆固醇血症组、高甘油三酯血症组、混合型高脂血症组和对照组中基因 C677T位点不同基因型的血脂水平见表4。各组不同基因型间血脂水平不具有显著性差异（P＞005）。

3  讨论
MTHFR是Hcy代谢关键酶之一。该酶将5 ,10亚甲基四氢叶酸还原为甲基四氢叶酸，后者是Hcy再甲基化甲硫氨酸的甲基供体，MTHFR基因缺陷将会导致Hcy代谢障碍，形成高Hcy血症。MTHFR 基因C677T突变是MTHFR最常见的一个突变，该突变可引起MTHFR酶耐热性和活性下降，从而血中Hcy水平升高［3］。近年来，流行病研究显示MTHFR基因C677T位点T等位基因变异可以使动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等心脑血管疾病患病危险性增加，但机理还未完全阐明。高脂血症不但是一种严重危害人类健康的疾病,而且还是冠心病和动脉粥样硬化等心血管病的主要危险因素。目前有关MTHFR基因C677T位点变异和高脂血症的关系的研究甚少，而且结果也不一致。H Yilmaz等［4］对29位肾移植病人的MTHFR基因C677T位点基因多态性的研究表明：C等位基因对血脂水平有保护作用，而T等位基因具有危害作用；含有T等位基因变异的个体要比CC基因型的个体TC和LDLC都要高，而且具有显著性差异。而国外其它一些研究则未显示MTHFR基因C677T位点变异对血脂水平有影响［5，6］。国内毛福梅等所做研究虽显示TC、TG随着T等位基因频率的升高有小幅度的提高，但这种差异不具有显著性［7］。
本次研究从遗传变异的角度探讨了中国人MTHFR基因C677T基因多态性与高脂血症的关系。结果显示高脂血症组与对照组之间基因型分布和等位基因频率差异有显著性(P＜005)。进一步按血清TC和TG水平将高脂血症分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症和混合型高脂血症三个亚组后再与正常对照组比较时，发现高胆固醇血症组与对照组之间基因型分布和等位基因频率差异仍具有显著性（P＜005）。与CC基因型相比，含有 T等位基因的个体患高胆固醇血症患病危险性是它的44倍，提示T等位基因可能是高胆固醇血症的一个危险因素。近些年来在动物实验、细胞培养以及人群流行病学研究中都曾发现血清Hcy与TC呈正相关［8，9］。Hcy可能会通过诱导内质网应激，活化肝细胞、血管内皮细胞、动脉平滑肌细胞中的未折叠蛋白反应及胆固醇调节元件结合蛋白，导致内源性固醇反应途径失调［10］，因此推测MTHFR基因C677T多态性可能通过影响Hcy水平而影响血清总胆固醇的代谢。但比较各亚组血脂水平时，没有发现高胆固醇血症组不同基因型血脂水平差异有显著性（P＞005），这一结果可能与样本量大小有关，需要在更大规模的人群中进行验证。此外，也有可能是血脂水平受遗传和环境因素共同影响；或单一基因多态性位点的作用可能是“微效”的。因此在控制其它危险因素的条件下，进行多基因多位点遗传性状的分析将是本研究下一步的工作重点。
综上所述，本研究可初步得出以下结论:MTHFR基因C677T位点多态性可能与高胆固醇血症密切相关，T等位基因可能是高胆固醇血症的危险因素。
参考文献
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