青年科学工作者论坛2007年第1期
Hen 论著
Cry1Ie基因在大肠杆菌中的表达及等同性鉴定
徐海滨 张晓霞 李芳 王国英[1] 刘允军1
中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京 100021
摘要：目的 以Cry1Ie基因表达蛋白为模式蛋白，建立外源基因表达蛋白的技术平台。方法 利用大肠杆菌系统高效表达Cry1Ie蛋白，并采用SDS-PAGE技术分离纯化，通过生物学活性和免疫反应性两项指标检测了大肠杆菌表达蛋白与转基因玉米中蛋白的等同性。结果 大肠杆菌表达系统可以产生大量的Cry1Ie蛋白，所获得的蛋白与转Cry1Ie玉米表达的Cry1Ie蛋白有相同的免疫反应性和生物活性。结论 大肠杆菌表达系统可以作为Cry1Ie外源基因蛋白表达技术平台用于转基因植物食用安全性的初步研究。
关键词：转基因玉米 Cry1Ie蛋白 大肠杆菌 实质等同性 蛋白表达和纯化
中图分类号：TS 201.6 Q786 TS 201.3 文献标识码：A
Expression and identification of Cry1Ie in Bacillus coli
XU Haibin, ZHANG Xiaoxia, LI Fang, WANG Guoying, et al.
Institute of Nutrition and Food Safety, Chinese for Disease Control and Prevention, Beijing 100021, China
Abstract：Objective In this study, Cry1Ie expressed protein in the transgenic Cry1Ie maize is used as a model protein to establish a technical platform for the safety assessment of other genetically modified plants. Methods Bacillus coli expression system was used to express Cry1Ie protein and then the expressed protein was purified by SDS-PAGE. The equivalence of Cry1Ie proteins expressed in Bacillus coli and in transgenic Cry1Ie maize was analyzed by their immunorecognition and bioactivity. Results Cry1Ie protein was highly expressed in Bacillus coli and could be segregated and purified by SDS-PAGE. Cry1Ie expressed protein in Bacillus coli is substantially equivalent to that of Maize Genetically Modified with Cry1Ie in tests of immunorecognition western blot and bioactivity in target pest. Conclusion The established technical platform of external Cry1Ie expressed protein can be applied to assess the food safety of genetically modified plants.
Key words: genetically modified maize, Cry1Ie, Bacillus coli expression, substantial equivalence, protein expression and purification
以重组DNA技术为代表的生物技术是21世纪最重要的高新技术之一。随之转基因作物商品化的发展，转基因食品在给人们带来巨大的经济与社会效益同时，其食用安全性问题日益受到各国政府、学术界和消费者的关注。评价转基因食品及食品成分是否与目前市售的传统食品具有实质等同性是食品安全性评价的一个重要方面。
Bt杀虫蛋白基因来源于苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis即Bt杆菌)，是天然存在于土壤中的格兰氏阳性菌[1]，在其芽孢形成过程中产生许多以结晶方式存在的蛋白质，这些蛋白质具有杀虫活性， 通常也被称为Bt杀虫蛋白。Bt蛋白是引入转基因植物的主要杀虫蛋白之一，Cry1类蛋白主要对鳞翅目害虫具有特异性杀虫活性，Bt杀虫蛋白按氨基酸序列的同源性可分为45大类313种[2]。目前已经发现多种Cry1蛋白有Cry1A类、Cry1B类、Cry1C类、Cry1D类、Cry1I类等。Cry1Ie抗虫基因属于BT杀虫蛋白家族，是我国科学家首次分离克隆出来的一种新的Cry基因。以此蛋白作为模式蛋白，选择适合的高效表达目标基因编码蛋白的表达系统，获得目标蛋白，并对此蛋白进行等同性分析，为开展毒性评价，建立外源基因表达蛋白的评价提供技术平台。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统[3]，此系统具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优点，本研究利用这一重要工具进行转Cry1Ie蛋白的表达及等同性鉴定。
1 材料与方法
1.1 菌种与质粒
Cry1Ie基因的原始序列为GenBank中的序列AF211190。所用大肠杆菌菌株为DH5α和BL21菌购自道普公司，原核表达载体pET28b和PUC19Ie由中国农业大学农业与生物技术国家重点实验室刘允军博士提供。
1.2主要实验仪器和试剂
DNP－9162生化培养箱、BECKMAN台式冷冻离心机、PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 9700)、Bio-brand电泳槽、HITACHI分光光度计、STUART系列磁力搅拌器、Bio-Rad公司Mini Trans-blot Electrophoretic Transfer Cell电转仪、MK-3酶联检测仪。限制性内切酶NdeI、SalI、T4 DNA连接酶购自promega公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、低分子量Marker、卡那霉素（Kan）、小牛血清白蛋白（BSA）、溶菌酶、酶标板(Coster)、透析袋等购自Sigma公司，50%Ni-NTA slurry购自QIAGEN，其它常用试剂和药品购自华美、天为时代、道普等国内公司，DNA快速纯化/回收试剂盒购自鼎国公司。
1.3含有转化载体的大肠杆菌DH5α感受态细胞构建和大肠杆菌BL21细胞的转化
DH5α感受态细胞中加入20μl连接产物，混匀内容物，在冰中放置30min。将管放到预加温到42℃的循环水浴中90s，迅速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min，加LB培养基200μl，置于37℃摇床振摇培养，温育45min使细胞复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因，将100~300μl已转化的感受态细胞涂布到含相应抗生素的LB固体培养基上，于37℃培养12~16h，用鉴定好的原核表达载体转化大肠杆菌BL21细胞，已备筛选。
1.4 Cry1Ie表达蛋白的可溶性分析和优化条件筛选
收集已诱导的细胞，弃除上清液，沉淀加入等体积的2x上样缓冲液，充分悬浮菌体，沸水中煮沸变性5min，冰浴2min。12000r/min，4℃下离心1min，灌制12%的分离胶，灌胶完毕后，插入梳子,静置40min。待胶凝固后，装配好胶槽，加入电极缓冲液，取20ml处理好的样品上样、跑胶，取出凝胶于染色液中染色1h，取出凝胶于脱色液中脱色2~3次,每次15min，用于蛋白的测定。
于已弃除上清液的沉淀中加入1/10体积的TE重悬细胞沉淀，加入10mg/ml的溶菌酶（用新鲜的TE缓冲液配制）至终浓度为100mg/ml。然后加入1/10体积的Triton-100，30℃培养15min，将离心管放入冰水浴中，超声波处理剪切DNA，12000r/min，4℃下离心15min。取上清液和沉淀物分别进行电泳。上清液含有可溶性蛋白，可以加入等体积的2×SDS上样缓冲液后，煮沸5min，12000r/min，室温离心5min，取30ml上清液进行电泳分析；沉淀含有包涵体，可使用1×SDS上样缓冲液重悬后，煮沸5min，12000r/min，室温离心5min，取30ml上清液进行电泳分析。
配制不同浓度的IPTG和IPTG诱导不同时间，分别通过蛋白测定和电泳分析筛选Cry1Ie蛋白表达最佳优化条件。
1.5 Cry1Ie表达蛋白的纯化（切胶回收法 ）和蛋白含量的测定
酶切片段及PCR产物的电泳回收采用DNA快速纯化/回收试剂盒（鼎国公司产品）进行纯化和回收，凝胶回收法中目的蛋白的测定采用Werstern bolt方法，菌液蛋白含量的测定采用考马斯亮兰G250法。
1.6 转Cry1Ie基因玉米叶片目的蛋白的提取
转Cry1Ie基因玉米由中国农业大学王国英教授惠赠，叶片中目的蛋白的提取方法由中国农业大学农业与生物技术国家重点实验室刘永军博士提供。将0.5g转Cry1Ie基因玉米叶片用镊子放入2ml离心管中，加入液氮充分研磨，待液氮挥发完后，加入1ml目的蛋白提取buffer，猛烈震荡10min，10000r/min，4℃离心10min，取20μl上清，加入5μl 5×SDS buffer，于100℃加热5min，立即置于冰上冷却至室温，12000r/min，4℃离心10min；取上清，-20℃保存备用。
1.7 Cry1Ie表达蛋白的等同性鉴定
1.7. 1 亚洲玉米螟的杀虫活性测定 称取5g人工饲料置于一灭菌培养皿中，分别加入1ml转Cry1Ie基因玉米叶片目的蛋白或大肠杆菌表达Cry1Ie蛋白溶液，以空载体作为阴性对照，将提纯蛋白质的Buffer作为空白对照。充分混匀，分装于经消毒（5%福尔马林浸泡）的24孔细胞培养板中。用毛笔轻轻接入玉米螟除孵幼虫，每孔一头，每处理重复3次，放置25℃光照培养箱中，培养7天调查死、活虫数，及虫玉米螟的平均虫重[4]。
1.7. 2免疫反应活性测定 转Cry1Ie基因玉米叶片目的蛋白或大肠杆菌表达Cry1Ie蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳和Western 印迹实验，分别测定并比较转Cry1Ie基因玉米叶片目的蛋白或大肠杆菌表达Cry1Ie蛋白免疫反应活性，方法参见《 Moleculer Cloning》[5]。
2 结果
2.1含有转化载体的大肠杆菌DH5α感受态细胞构建和大肠杆菌BL21细胞的转化
用NdeI和SalI酶切载体pET28b，回收5.3kb片段。用NdeI和SalI酶切载体pUC19Ie，回收2.2kb片段，进行连接反应。构建所得原核表达质粒命名为pETIe，用不同酶进行酶切鉴定，表明载体构建正确（图1）
M：1 kb DNA ladder Marker；1：NdeI 酶切；2: SalI 酶切；3：NdeI、SalI 酶切
图1 质粒pETIe的酶切鉴定
2.2 Cry1Ie表达蛋白的可溶性分析和优化条件筛选
将500ml菌体分为10管，每管50ml，1~9管加入IPTG终浓度分别为0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mmol/L，第10管加IPTG终浓度为0.5mmol/L，分别于诱导1、2、3、4、6、8、10、12h取1ml菌液。菌体收集后经超声破碎后，弃去上清，菌体沉淀有大量的目的蛋白。通过SDS-PAGE电泳分析IPTG诱导不同条件与诱导Cry1Ie蛋白表达含量的关系，发现在IPTG 0.3mmol/L浓度（图2泳道7）、IPTG诱导4小时（图3泳道5）时，Cry1Ie蛋白表达量最高，是高效表达的最佳优化条件。
1：未诱导的BL21/pETIe 菌液，2~10：IPTG诱导浓度分别为0.01、0.03、0.05、0.07、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L
图2 不同IPTG诱导浓度序列
1：未诱导的BL21/pETIe 菌液，2~10. IPTG诱导时间分别为1、2、3、4、5、6、8、10、12h
图3 不同IPTG诱导时间序列
2.3 Cry1Ie表达蛋白的纯化和蛋白含量的测定
用切胶回收法纯化Cry1Ie表达蛋白，共得到50ml纯化Cry1Ie蛋白，取20μl进行SDS-PAGE，通过与BSA标准样品比较，Cry1Ie蛋白表达的电泳条带大小与8μg的BSA电泳条带类似，推测Cry1Ie蛋白含量为400μg/ml，见图4。用考马斯亮兰G250，测定菌液中的Cry1Ie蛋白含量为420μg/ml，两种方法结果基本一致，提示蛋白质纯化与定量效果较好。
1：Marker；2、3：ry1Ie蛋白；4~9：1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、8μg；对照：BSA
图4 Cry1Ie表达蛋白的纯化和蛋白定量
|
97Kd
66Kd
43Kd
31Kd
|
2.4.1 亚洲玉米螟的杀虫活性测定 以0.5×10-6、5.0×10-6、250.0×10-6mg/kg的纯化Cry1Ie表达蛋白，载体菌液和缓冲溶液喂饲亚洲玉米螟，实验重复3次，观察其对杀虫率和平均虫重的影响。结果可见表，纯化Cry1Ie蛋白对玉米螟的生长抑制明显，用寇氏法算得Cry1Ie蛋白的LC50=2.1×10-5mg/kg，LC95%可信限1.5×10-5~2.8×10-5mg/kg，杀虫活性高，此结果与同期中国农业大学王国英教授实验室进行的转Cry1Ie玉米叶片的玉米螟虫试实验结果有良好的一致性，提示纯化Cry1Ie蛋白与转Cry1Ie玉米表达的抗虫蛋白具有相似性的生物学活性。
附表 纯化Cry1Ie表达蛋白对玉米螟虫杀虫活性的影响
|
受试物
（×10-6，mg/kg） |
重复（次） |
昆虫数 |
平均虫重
（mg） |
平均死亡率
（%） | |
|
接虫数 |
活虫数 | ||||
|
缓冲溶液 |
3 |
144 |
131 |
0.27±0.03 |
9.0 |
|
体菌液 |
3 |
150 |
135 |
0.36±0.09 |
10.0 |
|
0.5 |
3 |
144 |
106 |
0.27±0.03(1) |
26.2(1) |
|
5.0 |
3 |
144 |
121 |
0.30±0.05(1) |
16.0** |
|
250.0 |
3 |
144 |
38 |
0.13±0.10(1) |
18.7(1) |
注：（1）缓冲溶液和载体菌液比较P<0.01
2.4.2免疫反应活性测定 由图5和图6可见，转Cry1Ie玉米叶片中提取的Cry1Ie蛋白（泳道3）和大肠杆菌纯化的Cry1Ie蛋白（泳道4）进行Western blot分析，两种受试物在66kDa到97kDa区域同一位置出现明显的电泳条带，说明二者具有相同的免疫反应性。
M：低分子蛋白Marker；1：未诱导的BL21/pETIe 菌液；2：诱导的BL21/pETIe菌液；3：玉米叶中提取的浓缩Cry1Ie蛋白；4：从大肠杆菌纯化的Cry1Ie蛋白；5：诱导的BL21/pETIe包涵体
图5 免疫反应活性SDS-PAGE结果
图6 免疫反应活性Western blot结果
3 讨论
实质等同性原则注重于转基因植物与传统对比物差异的评价，转基因植物外源基因表达蛋白的安全性评价是现阶段转基因植物商品化的主要技术问题之一。目前的分离技术，尚不能从转基因植物中分离纯化出足够用于安全性评价的表达蛋白质产物，因此，可以用外源表达系统产生目的蛋白质。凡是以微生物表达的蛋白代替转基因植物中目的蛋白，需要符合以下的等同性验证标准[6]：①两者在二维凝胶电泳中表现一致； ②具有相同的结合单克隆、多克隆抗体的免疫反应性；③具有相同的翻译后修饰（如糖基化）；④具有相似的氨基酸序列（N末端10~15个氨基酸序列至少3个短的内部蛋白序列）；⑤具有相似的生物学活性。
本研究依据实际情况，选择了最具有代表性的生物学活性和免疫反应性两项指标。大肠杆菌表达的蛋白与植物蛋白在SDS-PAGE凝胶上大体处于同一位置，分子量相近，在Western blot分析中，两种受试物在66kDa到97kDa区域同一位置出现明显的电泳条带，显示具有相同的免疫反应性；大肠杆菌表达的Cry1Ie蛋白杀虫活性较强，Cry1Ie 蛋白LD50=2.1×10-5 mg/kg，LC95%可信限1.5×10-5~2.8×10-5mg/kg，与宋福平的实验结果（LC50=1.62×10-5，LC95%可信限5.35×10-6~3.9×10-5mg/kg）大体一致[7]；纯化Cry1Ie蛋白对玉米螟的生长抑制明显，与转Cry1Ie玉米叶片所进行玉米螟虫试结果有良好的一致性，表明纯化Cry1Ie蛋白与转Cry1Ie玉米表达的抗虫蛋白在生物活性上具有相似性。就目的蛋白的关键特性——生物活性和免疫反应性而言，实验结果提示大肠杆菌表达系统产生的目的蛋白与转基因植物目的蛋白基本是等同的，可以用于后续的食用安全性评价。切胶回收法回收蛋白纯度高，但对于大肠杆菌里高效表达的外源蛋白而言其置备效率偏低，蛋白生产量可以满足用量较少的体外试验和蛋白的稳定性实验，如果进行动物实验则受到产量的限制，需要摸索更高效率的纯化方法。
4 参考文献
1 ADAMS T B, DOULL J D, GOODMAN J I, et al. The FEMA GRAS assessment of furfural used as a flavour ingredient[J]. Food Chem Toxicol, 1997, 35: 739-751.
2 ANGSUTHANASOMBAT C, CRICKMORE N, ELLAR D J. Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis CryIVA and CryIVB cloned toxins reveals synergism in vivo[J]. FEMS Microbiol Lett,1992 ,73 (1-2):63-68.
3 HOCKNEY R C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli[J]. Trends Biotechnol, 1994，12（11）: 456-463.
4 段灿星，张青文，徐 静,等. 虫内生工程菌对亚洲玉米螟的杀虫效果及其在植株体内的动态变化[J].中国农业大学学报, 2002，7（5）：75-79.
5 SAMBROOK J. Moleculer Cloning. 2nd Ed .1989:74-84.
6 SAP Bt plant-pesticides（2000）“Bt Plant-Pesticide Risk and Benefit Assessments,” FIFRA Scientific Advisory Panel Report , No.2000-07, March 12,2001
7 宋福平, 张杰, 韩岚岚,等. 对鳞翅目害虫有活性的crylC基因的克隆和表达[J]. 植物保护学报,2003，30（2）：161-165.
作者简介：徐海滨，男，博士，研究员，博士生导师
1 中国农业大学生物技术中心
调查研究
三种宣教干预方式对小学生营养知识、态度、行为的影响
王灿楠 赵华硕[1] 刘沛 居培1 贺珍1 丛宁1
东南大学公共卫生学院营养与食品科学系，南京，210009
摘要：目的 探索不同营养宣教方式对小学生营养知识、态度、行为（K-A-P）的影响。方法 采取整群随机抽样的方法，对徐州市四所小学3~5年级的1477名小学生和他们的家长，采用举办专题讲座，发放宣传材料，出营养知识宣传板报，举办家长营养知识学习班等方法，进行单独学生干预、单独家长干预、学生及家长联合干预的营养知识宣传教育，比较接受不同宣教方式的小学生营养知识、态度、行为等方面的变化。结果 经过三种方式的营养宣教后，虽然小学生的营养知识水平及膳食行为均有不同程度提高，但以对学生及家长联合干预的效果最好，其次是对学生的干预。结论 在改进小学生营养知识、态度、行为的过程中，学校扮演了一个比家长更为重要的角色。
关键词：营养 知识-态度-行为 小学生 家长
中图分类号：R153.2 文献标识码：A
Effect of three ways of nutritional education on knowledge, attitude and practice with nutrition in pupils
WANG Cannan, ZHAO Huashuo, LIUu Pei, JU Pei, et al.
School of Public Health, the Southeast University, Nanjing 210009, China
Abstract Objective To explore the effects of different nutritional education ways on knowledge, attitude and practice with nutrition in pupils. Methods According to cluster randomization sampling methods, application three ways of nutritional education, nutritional education for pupils, nutritional education for pupils’ parents and nutritional education for both pupils and their parents, to 1477 pupils from three, four and five grades in primary school in Xuzhou city. Results Although each of three ways can improve the level of nutrition knowledge and diet behavior, the way of nutritional education for both pupils and their parents gets the best effect and the following is the way of nutritional education for pupils. Conclusion Primary schools play a more important role than pupils’ parents for improving pupils’ knowledge, attitude and practice with nutrition.
Key words: nutrition, knowledge-attitude-practice, pupil and parent
小学生正处于生长发育时期，也是各种饮食行为和习惯形成的关键时期。采取有效的营养教育方式，提高儿童青少年的营养知识水平，帮助他们建立良好的饮食习惯，对于提高小学生当前及将来的健康水平具有重要意义。虽然，有关营养知识-态度-行为（K-A-P）的调查已有一些报道[1~6]，但对采取学生干预、家长干预、学生及家长联合干预三种不同方式进行纵向随访研究的报道不多。根据“无论劝阻和鼓励哪种行为，都必须把力量集中到习惯形成的最早场合”的健康教育学原理[7]，本研究采取学校教育和家庭教育相结合的方法开展营养宣教活动，通过比较不同宣教方式的效果，既分析学校、家庭的独立作用，又分析学校、家庭的联合作用，从学校和家庭两个方面入手，以期帮助小学生从小建立良好的饮食习惯。为此，我们按整群抽样方法在徐州市随机选取4所小学校对3~5年级1477名学生和他们的家长进行了为期一个学期的营养宣教，并按流行病学前瞻性研究方法随访其宣教前、后营养知识-态度-行为的变化情况，现将结果报告如下。
1方法
1.1调查对象及分组
以整群抽样方法从徐州市随机抽取4所小学3~5年级的33个班级共1477名学生作为调查对象。将四所学校随机分为：对照组（不干预），学生干预组，家长干预组，学生、家长联合干预组。
1.2 宣教内容及干预措施
根据小学生膳食特点及存在问题，围绕中国居民膳食指南、膳食宝塔、膳食补钙、及早餐进食情况等设计营养知识、营养态度、膳食行为三个方面的问题共43道。预调查提示，学生及家长可在5~10分钟内完成答卷。在完成基线调查后，立即进行随机分组，然后，进行为期一个学期的营养宣教活动。干预措施包括：由营养专家举办营养专题讲座，发放营养知识宣传材料，出营养知识宣传板报，举办家长营养知识学习班等。宣教活动结束，对学生和家长进行干预后的随访调查。
1.3 KAP评分
KAP调查问卷由课题组根据研究目的、调查对象特点等反复讨论，并经预调查修改完善后确定。知识、态度、行为三方面的满分各为100分，根据各部分题量多少赋予每题一定分值，再根据答题者的选择计分并累加各题的分值作为最终得分，项目中的缺失值不参与计
分及统计分析【8】。
1.4统计分析
采用EpiData3.1软件建立数据库并进行双人双机数据录入，按实际数据的可能取值范围，编写Check文件对数据进行逻辑核对。采用SPSS11.0软件进行方差分析和秩和检验。
2 结果
2.1基本情况
此次共获得合格学生问卷1477份，家长问卷1470份。学生中男生798人，女生679人，性别比为1.18:1。其中，谷山小学（对照学校）398人，卧牛小学（家长宣教）366人，拾屯小学（学生宣教）322人，苏山小学（家长、学生均宣教）391人。
2.2学生营养知识-态度-行为（K-A-P）得分
有关营养知识的得分情况见表1。从表1可知，接受营养宣教的3所小学的营养知识得分在宣教后均有提高，宣教前后的得分差别具有统计学意义（P<0.01）；3所小学宣教前后的差值与对照学校比较差异有极显著性（P<0.01）。
表1 学生的营养知识得分
Table 1 Score of pupils’ nutrition knowledge（x±s）
|
组别 |
人数 |
宣教前 |
宣教后 |
差值 |
|
对照学校 |
325 |
59.92±11.65 |
60.42±11.90 |
0.49±13.52 |
|
家长宣教 |
300 |
56.73±8.82 |
62.05±10.09(1) |
5.32±11.55(2) |
|
学生宣教 |
264 |
55.09±10.39 |
64.34±12.75(1) |
9.24±14.03(2) |
|
家长学生均宣教 |
309 |
58.62±10.60 |
67.15±11.70(1) |
8.53±12.77(2) |
注： (1)与宣教前比较P<0.01，(2)与对照组比较P<0.01
学生营养态度得分见表2。从表2可知，各学校小学生营养态度得分在宣教前后基本一致。只有学生和家长均接受宣教的学校，宣教后学生的态度得分比宣教前提高（P<0.01），其提高的分值与对照组相比也有统计学意义（P<0.01）。其他三所学校宣教前后差值比较差异无显著性（P>0.05）。
表2 学生营养态度得分
Table 2 Score of pupils’ nutrition attitude（x±s）
|
组别 |
人数 |
宣教前 |
宣教后 |
差值 |
|
对照学校 |
355 |
85.46±17.55 |
83.37±20.31 |
-2.09±20.48 |
|
家长宣教 |
335 |
81.85±18.25 |
79.80±17.67 |
-2.05±20.24 |
|
学生宣教 |
295 |
78.31±19.89 |
77.79±19.12 |
-0.52±22.85 |
|
家长学生均宣教 |
359 |
81.11±20.08 |
85.12±16.35(1) |
4.01±20.39(2) |
注： (1)与宣教前比较P<0.01，(2)与对照组比较P<0.01
学生饮食行为得分见表3。从表3可知，单独对小学生进行营养宣教及对学生、家长均宣教的两所小学的营养行为得分在宣教后得到提高（P<0.01），所提高的分值与对照学校比较也具有统计学意义（P<0.05）。而对照学校及对家长宣教学校的饮食行为得分在宣教前后差异无显著性（P>0.05）。
表3 学生饮食行为得分
Table 3 Score of pupils’ nutrition behavior（x±s）
|
组别 |
人数 |
宣教前 |
宣教后 |
差值 |
|
对照学校 |
259 |
57.73±14.46 |
57.60±14.09 |
0.13±14.82 |
|
家长宣教 |
283 |
60.16±16.49 |
59.74±12.77 |
-0.41±16.37 |
|
学生宣教 |
252 |
59.06±15.99 |
62.32±13.96 (1) |
3.25±15.93 (2) |
|
家长学生均宣教 |
297 |
65.17±14.64 |
68.86±12.61 (1) |
3.69±15.79 (2) |
注： (1)与宣教前比较P<0.01，(2)与对照组比较P<0.01
2.3 学生食用早餐情况
宣教前后学生食用早餐情况见表4。从表4可知，学生宣教组，家长和学生均宣教组在宣教后每天吃早餐的比例比宣教前提高了1~3个百分点，但差异无统计学意义（P>0.05）。
表4 宣教前后学生食用早餐情况比较
Table 4 Comparison of pupils’ breakfast between before and after of nutrition education %
|
组别 |
宣教前 |
宣教后 | ||
|
每天吃 |
不是每天吃 |
每天吃 |
不是每天吃 | |
|
对照学校 |
89.3 |
10.74 |
89.9 |
10.13 |
|
家长宣教 |
86.6 |
13.39 |
90.7 |
9.32 |
|
学生宣教 |
89.4 |
10.62 |
92.8 |
7.21 |
|
家长学生均宣教 |
93.5 |
6.53 |
94.9 |
5.08 |
2.4 学生食用豆制品情况
宣教前后学生食用豆制品情况见表5。由表5可看出，各学校学生在营养宣教前食用豆制品的情况相似（P>0.10）；营养宣教后，各学校学生食用豆制品的比例发生改变（P<0.001）。进一步分析发现，家长宣教学校与对照学校比较，差别无统计学意义；学生宣教及学生、家长均宣教学校与对照学校间的差异有极显著性（P<0.01），且这两所学校宣教前后的差异也有极显著性（P<0.01）。
表5 宣教前后学生食用豆制品情况比较
Table 5 Comparison of pupils’ intake of bean between before and after of nutrition education %
|
组别 |
宣教前 |
宣教后 | ||||||
|
天天 |
经常 |
偶尔 |
不吃 |
天天 |
经常 |
偶尔 |
不吃 | |
|
对照学校 |
15.1 |
50.4 |
19.9 |
14.6 |
11.0 |
45.4 |
22.6 |
21.0 |
|
家长宣教 |
15.9 |
52.2 |
15.7 |
16.2 |
15.6 |
49.3 |
20.1 |
15.0 |
|
学生宣教 |
14.5 |
43.5 |
21.8 |
20.2 |
22.0 |
51.8 |
16.1 |
10.2 |
|
家长学生均宣教 |
19.2 |
49.1 |
16.5 |
15.2 |
41.6 |
45.9 |
8.0 |
4.5 |
3讨论
3.1小学生营养K-A-P现状分析
本次调查结果显示，小学生营养知识在宣教前平均只有57.6分，提示小学生的营养知识水平有待提高。但小学生关注自身健康，乐于接受营养知识的宣传教育，其态度得分平均达81.7分，积极的态度为进行营养宣传教育奠定了良好基础。由于营养知识欠缺，直接影响了他们的饮食行为，表现为小学生膳食行为得分不高，平均只有60.5分。这些结果均说明了对小学生开展营养宣教的必要性。
3.2 不同宣教方法对小学生营养的K-A-P影响
在本次研究中，对小学生直接进行营养宣传教育的两所学校的学生，宣教后的饮食行为得分均比宣教前提高；所提高的分值与对照学校比较也具有统计学意义。而仅对家长进行宣教的学生以及对照学校的学生，饮食行为得分在宣教前后未见差别。这一现象在营养丰富、价格低廉的豆制品食用变化上表现的更为明显。小学生正处于生长发育阶段，对营养知识的求知欲强，饮食行为的可塑性大，及早进行教育，有利于形成良好的饮食习惯，对其一生的健康意义重大[7]。本次研究提示，在这一过程中，学校可能扮演了一个比家长更为重要的角色。
在本次营养宣教干预中，小学生在早餐行为上的改变不明显。这可能与原来学生中每天吃早餐的比例比较高，加之宣教时间较短，宣教内容较广，学生改变已形成的饮食习惯需要一定的时间等有关。由此也使我们认识到，要培养学生良好的饮食习惯和健康行为需要进行有效、长期的不懈努力，才能达到最终目的。
3.3 组间可比性及偏倚控制
为保证组间的可比性，我们主要采取了两项措施。一是在试验分组时采取了两次随机化，即随机抽取试验单位和将试验单位随机分配入4个组。因影响营养宣教效果的因素较多，故严格遵循随机原则是保证组间可比性的关键环节。二是为减少各学校基线水平对结果的影响，在评价干预效果时，我们用各组干预后结果减去其相应基线结果，然后比较组间差值的方法，从而增加了组间的可比性。
在一个较大规模的人群随访研究中，极易出现导致研究结果系统偏离真实情况的现象[9]。为控制“试验污染”（trial contamination），在干预过程中，我们尽可能使对照组不受到本次营养宣教活动的影响，并规定在基线调查后，立即进行随机分组，以最大限度消除“调查偏倚”[9]。为减少失访偏倚，我们积极争取学校主管部门和校方的配合，使得本次调查没有发生群（学校、班级）水平上的失访，并尽可能减少了个体失访。虽然上述措施对控制偏倚具有积极作用，但由于小学生对调查问卷在理解上和认真程度上的差异，在一些项目的填写上出现了一些错误和缺项，这对结果可能会产生一定的偏性影响。另外，为遵循医学伦理学“收益人群最大化”原则，我们将对对照学校进行补干预，使其也能受到本次营养宣教干预活动所带来的益处。
参考文献
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2 孙静，马冠生，胡小琪，等. 对学生家长营养知识和行为的现状调查[J]. 中国学校卫生，1995,16（5）：384-385.
3 谢斌，赵熙和，贾健斌，等. 北京、广州、上海城市居民营养知识、态度、行为的调查[J]. 卫生研究，1997,26(5)：343-348.
4 赵丽云，翟凤英，李丹，等. 中学生的营养知识、态度和行为在营养教育前后的变化[J]. 中国学校卫生，2002，23(2)：147-148.
5 白锦，李国俊，王淑琴，等. 北京东城区居民营养知识水平调查[J]. 卫生研究, 1994, 23:298-230.
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7 黄敬亨. 健康教育学[M]. 上海：上海医科大学出版社，1992.102-109.
8 CARLTON D J, KICKLIGHTER J R, JONNALAGADDA S S, et al. Design, development and formative evaluation of “put nutrition into practice”, a multimedia nutrition education program for adults[J]. J AM Diet Assoc, 2000, 100:555-563.
9 DONNER A, KLAR N. Design and analysis of cluster randomization trials in health research[J]. London：Arnold Press Inc, 2000: 52-76.
作者简介：王灿楠，女，教授，E-mail: wcnseu@126.com
1 徐州医学院卫生学教研室
论著
β淀粉样蛋白处理大鼠认知和微量营养素状况的变化
军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050
摘要：目的 观察认知功能损伤大鼠体内几种主要维生素和微量元素含量的改变。方法 30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、β淀粉样蛋白（Aβ）组和生理盐水组，每组10只。正常对照组不作任何处理，Aβ组双侧海马内注射Aβ（每侧10μg），生理盐水组海马内注射等体积生理盐水。实验周期两周。通过水迷宫试验、避暗试验检测大鼠认知功能；采用原子吸收分光光度法、微量荧光法等方法检测动物血清维生素A、维生素E、维生素C、维生素B2、维生素B6、叶酸及微量元素铜、锌、铁的含量。结果 海马内注射Aβ使大鼠认知功能有下降趋势；与正常对照组及生理盐水组比较，Aβ组大鼠水迷宫试验及避暗试验潜伏期均延长，且血清维生素C及铁含量明显下降（P<0.05）；各组大鼠其余指标均无显著性差异。结论 海马内注射Aβ可导致大鼠认知功能损伤以及血清维生素C、铁含量降低。
关键词：认知 微量营养素 β淀粉样蛋白
中图分类号：Q51 R151.43 文献标识码：A
Changes of cognition and micronutrient levels in rats treated by βamyloid protein
JIANG Yugang, FANG Hengtong
Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Tianjin 300050, China
Abstract: Objective To observe the changes of the cognition and micronutrient level in rats treated byβ amyloid protein. Methods Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, βamyloid group(Aβ) and saline group. The rats were injected Aβand Saline by bilateral intrahippocampus（10μg per lateral）in Aβ group and saline group separately. The experiment lasted 2 weeks.The cognition was identified by water maze and step through test. The contents of serum micronutrients were examined by atomic absorption spectrometry and fluorescence spectrometry. Results Declined cognition and prolonged latency were observed in Aβ group. The contents of serum vitamin C and iron in Aβgroup were significantly lower than those of the control group and saline group（P<0.05）. There was no significant difference among the three groups in other indicators. Conclusion It was seemed that impaired cognition and decreases of serum vitamin C and iron level could be observed in rats treated byβamyloid protein.
Key words: cognition，micronutrient，βamyloid protein
认知功能与营养关系密切。研究表明，维持脑的正常发育和功能不仅需要碳水化合物、氨基酸、必需脂肪酸等营养成分，还需要维生素、矿物质等微量营养素；维生素和微量元素通过参与构成酶活性中心，参与神经递质的合成，直接或间接地影响脑功能。但有关认知功能损伤条件下，机体微量营养素代谢变化的研究报道很少。为此，本研究拟通过海马内注射β淀粉样蛋白造成实验大鼠认知功能损伤，并进而观察几种主要维生素和微量元素的含量变化，为寻求保护脑功能营养措施的研究提供理论依据。
1材料与方法
1.1动物与分组
3~4月龄雄性SD大鼠，体重250~300g，由军事医学科学院动物中心提供。动物随机分为正常对照组、β淀粉样蛋白（Aβ1~40）组和生理盐水组，每组10只。正常对照组不作任何处理，Aβ组海马内注射1µl Aβ1~40，生理盐水组海马内注射等体积生理盐水。实验周期2周，大鼠自由饮水及摄食AIN－93配方饲料，其间每天记录大鼠摄食量，每3天称1次大鼠体重。
1.2认知功能损伤模型制备
Aβ1－40的孵育：用无菌生理盐水溶解Aβ1－40（Sigma公司），配成10µg/µl的溶液。使用前37℃孵育1周，使其变为凝聚状态。
制备程序：大鼠用1%戊巴比妥钠按40mg/kg bw麻醉后，立体定位仪上固定，皮肤消毒，使前后卤在同一水平，正中切取皮肤暴露颅顶前卤，参照《大鼠脑立体定位图谱》选定双侧海马坐标（P=-4.3mm，D=±1.9mm，H=3.8mm）钻开颅骨，孔径约1mm，用微量注射器每侧海马内缓慢注射10µg/µl Aβ1~40 1µl，1min注射完毕后留针5min。庆大霉素局部处理后，缝合切口[1]。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 认知功能检测 水迷宫法：采用大鼠从水迷路的起步点游泳到出口点的时间（潜逃潜伏期）作为反映大鼠空间辨别学习记忆功能的指标。
避暗实验：以大鼠从明室进入暗室的潜伏期作为反映大鼠学习记忆功能的指标。
1.3.2 维生素及微量元素检测 (1)维生素B2营养状况：采用全血谷胱甘肽还原酶活性系数(GR AC)评价[2]。(2)维生素B6营养状况：采用红细胞天门冬氨酸转氨酶活性系数(AST/GOT AC)评价[3]。(3)天门冬氨酸转氨酶活性：采用中生北控试剂盒测定。(4)血清叶酸水平：采用德普诊断产品有限公司放射免疫试剂盒测定。该试剂盒采用化学发光竞争免疫分析方法。(5)血清铁、铜、锌的含量：采用原子吸收分光光度法测定。(6)血清维生素A、E水平：采用微量荧光法测定。取50μl血清样本或100μl标准品加入0.25ml蒸馏水震荡混匀，加入无水乙醇0.5ml震荡混匀，加入环己烷1.5ml震荡混匀，3000r/min离心10min，取上清液于小比色杯中，测定340nm激发光下，480nm处的荧光强度，计算维生素A的含量；调整波长于295nm激发光下，340nm处测定荧光强度，计算维生素E含量。(7)血清维生素C水平：采用2,4-二硝基苯肼法测定。在Eppendoff管内加入5%三氯醋酸40μl，然后加入10μl血清或抗坏血酸标准工作液（2μg/ml）混匀，3000r/min离心10min。取上清液30μl与10μl硫脲、硫酸铜、2,4-二硝基苯肼混合液混匀，37℃保温4小时。冷却后，加入85%硫酸50μl混匀，在490nm波长下比色。
1.4 统计分析
数据以 x ±s 形式表示，显著性水平为P＜0.05。用SPSS11.5软件，对检测结果进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。
2结果
2.1 大鼠摄食及体重结果
Aβ组、生理盐水组和正常对照组实验期间各组平均每天饲料摄入量为（28.4±2.1）、（28.9±3.2）和（28.4±1.7）g；各组之间差异无显著性（P=0.883）。Aβ组、生理盐水组和正常对照组实验期间体重增加量分别为（79.4±18.6）、（87.6±17.2）和(83.6±16.3)g；各组之间差异无显著性（P=0.539）。
2.2 空间辨别学习记忆功能的改变
正常对照组、Aβ组和生理盐水组大鼠水迷宫潜逃潜伏期分别为（13.1±3.8）、（25.4±18.8）和（17.5±4.9）s，差异无显著性（P=0.068）。但Aβ组大鼠比正常对照组大鼠潜逃潜伏期有延长趋势。说明Aβ组大鼠记忆功能比正常对照大鼠记忆功能有所下降。
2.3避暗实验检测结果
Aβ组大鼠从明室进入暗室的潜伏期[（282±78）s]比正常对照组潜伏期[（214±110）s]长，但差异无显著性（P=0.206）。
2.4血清维生素A、维生素E、维生素C含量的测定结果
由表1可见，各组大鼠血清维生素A含量差异无显著性（P=0.082），各组大鼠血清维生素E含量差异无显著性（P=0.301）。Aβ组大鼠血清维生素C含量显著低于正常对照组及生理盐水组（P＜0.05）。
表1 各实验组大鼠血清维生素A、E、C含量(x±s) µg/ml
|
组别 |
n |
VA |
VE |
VC |
|
正常对照组 |
10 |
0.18±0.02 |
13.56±1.17 |
28.6±6.9(1) |
|
Aβ组 |
9 |
0.21±0.02 |
13.75±1.46 |
18.5±8.0 |
|
生理盐水组 |
10 |
0.19±0.04 |
12.97±0.65 |
28.2±4.5(1) |
注：（1）与Aβ组相比P<0.05
2.5 血清维生素B2、维生素B6、叶酸的测定结果
由表2可见，根据全血谷胱甘肽还原酶活性系数升高的程度可以判定核黄素缺乏的程度，AC>1.5为缺乏，各组大鼠均没有核黄素缺乏现象，且各组大鼠全血谷胱甘肽还原酶活性系数差异无显著性（P=0.507），说明维生素B2含量无显著性差异。红细胞天门冬氨酸转氨酶活性系数与机体维生素B6水平有关，超过1.8表明处于缺乏状态[3]；各组大鼠红细胞天门冬氨酸转氨酶活性系数差异无显著性（P=0.827），说明维生素B6含量无显著性差异。各组大鼠血清叶酸含量差异无显著性（P=0.815）。
表2 各组大鼠GR(AC)、AST/GOT(AC)、叶酸测定结果(x±s)
|
组别 |
n |
GR(AC) |
AST/GOT(AC) |
叶酸
（ng/ml） |
|
正常对照组 |
10 |
1.02±0.11 |
2.84±1.92 |
8.61±0.74 |
|
Aβ组 |
9 |
1.08±0.11 |
1.91±0.71 |
8.89±1.63 |
|
生理盐水组 |
10 |
1.04±0.03 |
1.93±0.57 |
8.63±0.63 |
2.6 血清微量元素铁、铜、锌的测定结果
由表3可见，Aβ组大鼠铁含量比正常对照组及生理盐水组显著低（P＜0.05＝），提示认知功能的维持需要铁的参与。各组铜含量差异无显著性（P=0.279）。各组锌含量差异无显著性（P=0.926）。
表3 各实验组大鼠血清铁、铜、锌的含量（x±s） mg/L
|
组别 |
n |
Fe |
Cu |
Zn |
|
正常对照组 |
10 |
1.33±0.51(1) |
0.46±0.07 |
0.78±0.09 |
|
Aβ组 |
8 |
0.77±0.29 |
0.42±0.04 |
0.79±0.06 |
|
生理盐水组 |
10 |
1.87±0.77(1) |
0.48±0.10 |
0.78±0.09 |
注：（1）与Aβ组相比较P<0.05
3 讨论
环境化学物诱导，机体自身抗氧化能力下降等均可导致认知功能损伤。β淀粉样蛋白是阿尔茨海默病中老年斑的主要成分，具有神经毒性。已有研究表明大鼠脑室内及Meynert基底核注射凝聚态Aβ对大鼠学习记忆都有一定损伤；海马与学习记忆特别是近事记忆功能密切相关，是阿尔茨海默病中最易受累的脑区之一，从结构和功能上分析，海马是学习记忆功能研究的理想靶区。也有研究者报道通过海马内注射Aβ造成大鼠认知损伤，海马出现病理学变化[11]。因此，我们选择大鼠双侧海马内注射Aβ，观察其认知功能损伤时维生素及微量元素含量的变化。
铁元素是脑认知形成的重要营养素之一。流行病学资料表明，缺铁性贫血儿童的脑发育水平及认知表现均低下，而只有经过长期铁制剂补充才使贫血儿童发育达到正常水平[12]。色氨酸、去甲肾上腺素、多巴胺等神经递质合成相关的酶发挥活性需要铁的参与。已有动物实验表明，铁缺乏会使额叶皮质多巴胺受体密度降低而造成认知缺陷。Resburg等发现，认知衰退老人血清铁含量较健康老人明显降低。本实验观察到认知功能损伤大鼠血清铁含量显著下降，提示认知功能与铁营养状况相互影响，铁缺乏可导致认知功能下降，认知功能下降也可能加重铁缺乏，互为因果。
氧化损伤是导致认知功能减退的原因之一，维生素C是重要的抗氧化物质，Aβ可促进自由基的产生，Aβ组大鼠体内VC含量显著下降，提示认知功能减退与抗氧化能力下降有关。VC、VE可明显提高神经细胞的存活率，拮抗神经元氧化损伤。VC可影响去甲肾上腺素等重要神经递质的合成，调节多巴胺受体及肾上腺素受体的结合。人体干预实验表明，富含抗氧化剂维生素C、E的饮食可预防老年人群阿尔茨海默病的发生[13]。结合我们的试验结果，提示β淀粉样蛋白造成的认知损伤会使机体抗氧化物质含量降低，导致机体对抗氧化应激的能力下降或神经递质代谢异常，从而进一步加剧认知损伤。
综上所述，通过海马内注射Aβ建立认知功能损伤的大鼠模型，并观察到与脑功能密切相关的营养素——VC及铁含量显著下降，这是神经毒剂Aβ的脑内作用结果，与自然衰老过程中认知下降有所不同，其机制途径如何，同时是否引起了细胞分子水平上神经信号的改变，尚需进一步研究。
参考文献
1