达能营养中心第十届学术研讨会论文集

张蕊 张梅 秦学艳 赵文娟 贾丽红^[1]

（中国医科大学公共卫生学院，沈阳，110001）

 

摘要:目的观察HQ对V79细胞存活率和线粒体膜电位的影响及LA的干预作用。方法在体外培养的V79细胞中分别加入不同浓度的LA和HQ，培养24h，采用流式细胞术和荧光显微镜分别检测细胞线粒体膜电位变化。结果与对照组比较，50μM以上HQ可导致V79细胞存活率和线粒体膜电位明显下降（P＜0.05）；50μM和100μM LA对V79细胞存活率和线粒体膜电位没影响，但能明显拮抗50μM的HQ对细胞存活率和线粒体膜电位的影响（P＜0.05）。结论一定浓度LA具有明显拮抗50μM HQ对V79细胞产生的毒性作用，其保护机制可能是通过线粒体途径进行的。

关键词：硫辛酸(lipoic acid，LA)；氢醌(hydroquinone，HQ)；线粒体膜电位；JC-1(5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide)；流式细胞术

 

线粒体是细胞内ATP的生产中心，在细胞凋亡、衰老、癌症和信号转导过程中发挥重要作用。近年来发现许多危害人类健康的疾病发生都与线粒体氧化损伤及其功能改变密切相关。线粒体功能受损的最早表现之一为线粒体膜电位的下降[1]。硫辛酸(Lipoic acid,LA)是目前受到关注的抗氧化剂之一，硫辛酸及其还原态二氢硫辛酸可以清除自由基和活性氧，螯合金属离子，再生谷胱甘肽、维生素C和维生素E等，可改善葡萄糖代谢，降低氧化应激，对糖尿病性白内障、多发性神经病及心血管损伤等糖尿病并发症有较好的预防和治疗作用，目前主要用于糖尿病人的辅助治疗[2-3]，对于LA其他方面的抗氧化研究国内报道较少。氢醌(hydroquinone,HQ)是苯在体内的重要代谢产物，也是香烟烟雾和焦油中的主要成分之一，HQ在体内代谢过程中可产生大量自由基导致支气管和肺的损伤，但目前确切机制尚不十分清楚。因此，本实验采用MTT和JC1的方法，检测HQ对体外培养的中国仓鼠肺纤维细胞(V79)的毒性作用，并重点研究HQ对线粒体膜电位的影响，同时选择硫辛酸作为抗氧化剂，进行干预性研究，为进一步研究与苯或吸烟有关的肺损伤发生机制，采取有效的预防与治疗措施提供理论依据。

 

HQ(Sigma)，LA(Sigma)，DMEM高糖培养液(HyClone)，胎牛血清(天津灏洋生物制品科技公司)，胰蛋白酶EDTA(Sigma)，JC1(Molecular Probes)，MTT(华美公司)，V79中国仓鼠肺细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。酶标仪：UV300，流式细胞仪：FACS Calibur(美国Becton Dickinson公司)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX71)。

LA和HQ分别溶于PBS中，LA配成储备液，保存在4℃冰箱中，HQ于每次实验使用前现配制。JC1用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为1mg/ml，低温贮存备用。

V79细胞用细胞培养液(DMEM培养液含10%胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素)按105/ml的细胞密度接种到96孔板、6孔板和培养瓶，置37℃，5%CO2培养箱中，每2天换液一次。待细胞达到生长空间的80%-90%时，换成含1%胎牛血清的培养液，并分组施加以下处理因素：①对照组。②HQ组：HQ终浓度为0、10、20、30、40、50、100、150(μM)。③LA组：LA终浓度为0、50、100、200(μM)。④LA+HQ组1：LA终浓度为0、50、100(μM)；HQ终浓度为50μmol/。⑤LA+HQ组2：LA浓度同④组，HQ终浓度为100μM。培养时间均24小时。每个浓度组均设6个平行样，且每个实验至少重复2-3次。

实验结束后，96孔培养板每孔加入20μl的MTT(终浓度为0.5mg/ml)，37℃培养4小时后，将各孔中液体吸弃，每孔加入200μl的DMSO，作用10分钟，馄均后用酶标仪在540nm处读取吸光度值A540nm。记录每个实验组的吸光度值，以细胞存活率表示：细胞存活率=实验组A540nm/对照组A540nm。

实验结束后，用37℃预热的完全培养液与JC1充分混合后(JC1终浓度为2.0μg/mL)加入到培养瓶中，37℃下避光染色30分钟，然后用PBS冲洗2次，离心后制成单细胞悬液，用流式细胞仪分别在485nm激发光和527nm、590nm发射光下测定红、绿色荧光强度，以红/绿荧光比值代表细胞线粒体膜电位；图像的分析采用Cell Quest软件，同时在倒置荧光显微镜下照像。

采用SPSS11.5统计软件中单因素方差分析处理，数据用x-±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

 

图1显示，与对照组比较，当HQ为40μM以上时，V79细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；并且HQ在40μM-150μM范围内，随着HQ浓度增高，V79细胞存活率下降，呈剂量-效应关系。

 

图1不同浓度HQ对V79细胞存活率的比较(x-±s，n=6)，与对照组相比，** P＜0.01

 

图2显示，与对照组比较，LA为50μM和100μM时，对细胞存活率没有影响，但此浓度下的LA可以明显拮抗50μM和100μM HQ所引起的V79细胞存活率的下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图2不同浓度LA对HQ作用下的V79细胞存活率的比较(x-±s，n=6)，与对照组相比，* P＜0.05,** P＜0.01;与HQ50（HQ100）组相比，^  P＜0.05; ^^ P＜0.05

 

图3显示，与对照组比较，50μM和100μM的HQ能使V79细胞线粒体膜电位明显降低；50μM LA对细胞线粒体膜电位没有影响。与单纯HQ组比较，50μM的LA能明显拮抗50μM和100μM的HQ对V79细胞线粒体膜电位造成的损伤作用。

图3LA对50和100μM的HQ所致V79细胞线粒体膜电位影响的干预作用

 

 

图4显示，正常V79细胞线粒体维持较高的膜电位，JC1在线粒体内形成聚合物，以红色荧光为主。50μM HQ可导致线粒体膜电位下降，JC1聚合物分解成单体，红色荧光强度减弱。LA单独作用时不改变线粒体膜电位，与HQ共同培养时可以拮抗HQ引起的线粒体膜电位下降。

 

 

 

图4倒置荧光显微镜结果

 

众所周知，吸烟能增加人类许多慢性疾病发生的危险性，尤其对肺组织的损伤作用更加明显。吸烟除了人们公认的尼古丁造成的危害之外，在吸烟的气相和焦油中还存在着大量对人体有害的自由基。有报道香烟的主流烟雾中HQ含量约为110～300μg/支[5]，它代谢产生的醌类自由基(Q·/QH·)大约占香烟烟雾和焦油中自由基的85%[6]，同时释放大量ROS，如超氧阴离子(O-2·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO·)和单线态氧(O)等[7]。目前许多研究表明，线粒体氧化损伤与许多疾病的发生有关。本实验结果显示：50μM和100μM的HQ能引起V79细胞存活率明显降低，细胞线粒体膜电位明显下降。荧光显微镜结果也显示，50、100μM的HQ作用于V79细胞时，JC1发出红色荧光的强度显著低于正常对照组，说明HQ能造成V79细胞线粒体膜电位的明显下降。JC1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC1为单体产生绿色荧光。因此通过观察荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位降低是线粒体功能障碍的标志之一，也是细胞凋亡的早期信号[8]；提示HQ导致V79细胞毒性作用可能是通过线粒体损伤途径进行的。

硫辛酸是一种重要的抗氧化剂，有研究指出其抗氧化性比维生素C和维生素E要强很多倍。LA在体内肠道吸收后进入细胞,兼具脂溶性与水溶性的特性,因此可以到达任何一个细胞部位,提供人体全面抗氧化作用。LA可清除羟自由基(HO·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(O)、一氧化氮自由基(NO)等。因此，目前有关其抗氧化作用是研究的热点之一。本实验结果显示，50、100μM的LA对V79细胞存活率和线粒体膜电位均没有产生任何影响，但对50μM和100μM的HQ造成的V79细胞线粒体损伤有明显的保护作用。国外有研究报道，50μM，100μM，200μM硫辛酸能拮抗丙二醛对人或大鼠视网膜上皮细胞造成的氧化损伤作用[4]。LA对老龄大鼠具有抗衰老作用[9]，对肝微粒体脂质过氧化模型的影响[10]，对大鼠全脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用[11]。因此本实验提示：LA拮抗HQ对V79细胞产生的毒性作用机制可能与其拮抗HQ对V79细胞线粒体造成的损伤作用有关。

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