达能营养中心第十届学术研讨会论文集
盛晓阳1 朱锡翔2 沈理笑1 薛敏波1 K. Michael Hambidge3
(1上海交通大学医学院附属新华医院儿童与青少年保健科,上海,200092；2云南省妇幼保健院,云南昆明,610000；
3Departement of Pediatric, Section of Nutrition, University of Colorado Health Science Center, Denver, CO, USA 80262)
摘要：目的采用因素分析可以估算微量元素锌的需要量。本研究希望通过对幼儿锌代谢平衡的测定，以所获得的数据估算幼儿的锌需要量。方法采用双稳定性同位素示踪方法标记同位素，收集大便和尿液，分析稳定性同位素丰度，计算锌的各项代谢平衡数据。结果在43名19-25月龄幼儿中检测到的主要结果（χ±SD）：膳食摄入锌量1.86±0.55mg/day；锌吸收率0.35±0.12；实际吸收锌量0.63±0.24mg/day；肠道内源性排出锌量0.67±0.23mg/day。由因素分析估算得到幼儿锌的生理需要量为1.09mg/day，锌的平均膳食需要量为3.3mg/day。结论根据实际测得的锌代谢平衡数据，由因素分析得到的幼儿锌的生理需要量和平均膳食需要量均略高于目前美国食物和营养委员会的估计值。
关键词：锌；幼儿；需要量；稳定性同位素
Zinc requirements in toddlers
Sheng Xiaoyang1 Zhu Xixiang2 Shen Lixiao1 Xue Minbo1 K. Michael Hambidge3
(Department of Child and Adolescent Health Care, XinHua Hospital affiliated to Shanghai Jiao Tong University,
School of Medicine, Shanghai, China 200092; 2Yunnan Maternal and Childrens Hospital, Yunnan,
Kunming China 610000;3Departement of Pediatric, Section of Nutrition, University of Colorado
Health Science Center, Denver, CO, USA 80262)
Abstract: ObjectivesA factorial approach is necessary to determine zinc requirements. Data required for this approach have not been available for toddlers whose requirements have been estimated by extrapolation from other age groups. The objective of this study was to evaluate the zinc intake of toddlers in China and to estimate toddler requirements for zinc. DesignThe major variables of zinc homeostasis were measured by giving 70Zn with all meals for one day as an extrinsic label and 68Zn intravenously. Fecal and urine were collected for measuring isotope enrichment. Results43 toddlers aged 19-25 months whose staple food was rice completed the study. Salient results (χ±SD) were: total dietary zinc (TDZ) 1.86±0.55mg/day; fractional absorption of zinc (FAZ) 0.35±0.12; total quantity of absorbed zinc (TAZ) 0.63±0.24 mg/day; endogenous fecal zinc (EFZ) 0.67±0.23mg/day. The estimated physiologic requirement for zinc=1.09mg Zn/day and estimated average dietary requirement=3.3mg Zn/day for toddlers. ConclusionThese results indicate that this population has suboptimal zinc intake and the estimated physiologic requirement for zinc and estimated average dietary requirement are higher than current recommendations of FNB for toddlers.
Keywords: Zinc；toddlers；requirements；stable isotope
2001年，美国食物和营养委员会（Food and Nutrition Board，FNB）重新出版了针对微量营养素的“膳食参考摄入量（DIRs）”[1]。其中对人体锌需要量的估算采用了因素分析方法，根据在成年男性中实施的采用稳定性同位素的人体锌代谢平衡数据，计算并制定了锌的生理需要量、估计的平均膳食需要量（EAR）和膳食推荐摄入量（RDA）[1]。然而由于缺乏足够的数据其他人群都只能从这些成年男性的数据中推算。
本研究的目的：(1）测定幼儿锌代谢平衡数据；(2）利用这些数据估算幼儿锌的生理需要量和平均膳食需要量。
1研究对象和方法
1.1 实验设计
在保持幼儿习惯性膳食并在家庭环境中测定其锌代谢平衡数据。在代谢实验期第1天，随每次进餐口服70Zn，并在当天中午静脉注射68Zn。收集所有大便和每天两次的中段尿，测定其中的同位素丰度。锌吸收率（FAZ）测定采用双同位素示踪方法（DITR）[2-3]，肠道内源性排出锌量（EFZ）测定采用同位素稀释方法[3]。收集双份食物测定膳食摄入锌量（TDZ）。血浆锌测定用于评估幼儿锌营养状况。应用与FNB相同的方法计算幼儿从尿液和皮肤丢失的锌[1]。利用FNB推荐的因素分析方法估算幼儿锌的生理需要量和平均膳食需要量[1]。
1.2 研究对象
43名，19-25月龄的云南省文山州西畴县的健康幼儿参加了本次研究。其中女性24名，男性19名。这些幼儿以米饭为主食。本研究得到了上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会以及Colorado Multiple Institutional Review Board的批准。每一名幼儿的父母均签署了知情同意书。
1.3 稳定性同位素制剂的制备和标记
口服和静脉注射的锌稳定同位素制剂均按标准方法进行制备，制剂的安全性通过了美国科罗拉多大学健康科学中心和上海市药监局的检测。制剂中的锌浓度用原子吸收方法测定，并按同位素的纯度和原子量进行矫正。
经准确称量的68Zn（0.5mg）于代谢实验期第1天的中午经肘静脉注射，整个注射过程约10分钟。总量约为0.2mg的70Zn（实际剂量经准确称量），于代谢实验期第1天根据幼儿各餐中锌含量的比例进行分配；在每次进餐到一半时随进餐慢慢口服。
1.4 样品收集
代谢实验期的第5~9天，收集幼儿的双份食物并扣除幼儿未进食部分，用于实际测定其中锌和植酸含量。从第一次口服70Zn起就收集幼儿所有的大便，标记时间和重量。代谢实验期的第5~9天，每天两次收集中段尿并标记时间。在静脉注射同位素之前先收集1ml血液样品并分离血浆。所有样品均-20℃储存，送到美国科罗拉多大学健康科学中心、营养部、儿童营养实验室进行处理分析。
用标准方法分别在代谢实验期的第1天和第30天对幼儿的身高和体重进行准确测量。采用Epi Info软件计算幼儿身高和体重的Z-评分，该数据库采用的是NCHS/CDC/WHO 1977儿童生长参考值。
1.5 样品处理和分析
食物和大便样品经准确称量后充分匀浆，取部分匀浆烘干，再经两次450℃高温灰化24小时。灰化的食物和大便样品重溶于盐酸溶液中，采用原子吸收法测定锌浓度，并依此计算幼儿摄入锌量（TDZ）及从大便排出的总锌量（TFZ）。
重溶的大便样品经AG1树脂离子交换去除其他的无机离子而提纯锌。
尿液样品由MDA2000微波消化系统处理。5ml尿液加1ml浓HNO3，逐步提高压力至120psi。总的消化时间约90min。消化后的样品经低温烘干重溶于醋酸胺缓冲液中（pH=5.6）。经三氟乙酰丙酮和正己烷螯合萃取提纯锌[4]。
由等离子耦合感应质谱仪（ICPMS）测定样品中68Zn/66Zn和70Zn/66Zn的比例。锌的同位素丰度定义为样品中某一标记同位素锌量除以样品总锌量。
血浆锌浓度采用原子吸收法进行测定。以血浆标准参考物（SRM1598）作质量控制。
采用高效液相色谱法测定食物样品中的6磷酸和5磷酸肌醇[5]。植酸测定的质量控制由实验室之间的比较而实行。
1.6 数据处理和分析
1.6.1 锌吸收率（FAZ）的计算采用DITR方法，根据尿液中测得的口服70Zn和静脉注射68Zn的丰度以及同位素剂量计算得到[2]，计算公式如下：
FAZ=同位素丰度（口服/静脉注射）×剂量（静脉注射/口服）
在代谢实验期的第5~9天，总共有10个尿液样品，取平均值作为FAZ。
1.6.2 实际吸收锌量（TAZ）的计算如下：TAZ（mg/d)=TDZ（mg/d）×FAZ
1.6.3 肠道内源性排出锌量（EFZ）由同位素稀释技术测定，以尿液的同位素丰度替代组织和血浆的同位素丰度[3]，计算方法如下：
EFZ(mg/d)=∑(F×f)/(ua×d)
其中，F是大便样品的总锌量（mg），f是大便样品中静脉注射的同位素丰度，ua是同一代谢期尿液中静脉注射同位素丰度，d是代谢期的时间长度（本研究中为5天）。
1.6.4 幼儿锌的生理需要量计算如下：以TAZ为横坐标，EFZ为纵坐标，分析实际吸收锌量（TAZ）和肠道内源性排出锌量（EFZ）之间的直线回归相关性，随后加上估计的经尿液和皮肤等途径丢失的锌以及幼儿生长所需的锌，将该直线平行上移。直线与坐标对角线相交，相交点所对应的TAZ就是幼儿为弥补锌的丢失和维持生长而必须吸收的锌的量，也就是锌的生理需要量[1]。幼儿经尿液和皮肤丢失的锌量采用FNB估计的数值[1]，生长所需的锌量则根据幼儿在30天内平均每天增长的体重乘以组织中的锌含量20μg/g。
1.6.5 幼儿锌的平均膳食需要量的估算是通过分析TAZ与TDZ之间的相关性，并以上述所得的生理需要量的数值作为TAZ，而达到该TAZ时的TDZ，即为幼儿锌的平均膳食需要量[1]。
所有的结果均以χ±SD表示。采用GraphPad Prism软件进行数据的统计分析。以p＜0.05为有显著差异。
2结果
测定所得的幼儿各项锌的代谢平衡数据，包括TDZ、FAZ、TAZ、EFZ、膳食植酸量、以及血浆锌列于表。EFZ与TAZ的直线相关性分析见图1，而TAZ与TDZ的相关性见图2。幼儿在30天内体重增加5.1±6.5g/day。幼儿膳食中植酸:锌的摩尔比为2.7∶1，属于低植酸摄入。
TableMajor variables of zinc homeostasis 
经计算，幼儿锌的生理需要量为1.09mg/day，估计幼儿锌的平均膳食需要量为3.3mg/day。 
Figure.1肠道内源性排出锌量（EFZ，mg/day）与实际吸收锌量（TAZ，mg/day）的直线回归分析。回归方程式：y=0.3512(x)+0.4496;(r2=0.1862;p=0.0048)
Figure.2实际吸收锌量（TAZ，mg/day）与膳食摄入锌量（TAZ，mg/day）之间的线性回归。当直线回归起点为0时，线性回归方程式为：y=0.3328(x);(p＜0.0001)。
3讨论
本研究测定了幼儿锌代谢平衡的各项数据，包括膳食摄入锌量、实际吸收锌量、以及从大便排出的总锌量和肠道内源性排出锌量等。这些数据可用于以因素分析来估计锌的生理需要量和平均膳食需要量。
由于在该年龄幼儿中收集24小时尿液困难，同时尿液中的锌含量在很大范围内不受膳食锌的影响，只有在严重缺锌时尿液中锌的排出量才降低[6]，因此本研究中幼儿尿液中锌的排出量采用了FNB的估计值[1]；此外，由于通过尿液和皮肤等丢失的锌大约只占总的锌丢失量的20%，因此即使在估算上有一定的误差也不会明显影响最终估算的锌内源性丢失量。
本研究测得的幼儿实际吸收锌量（TAZ）略高于肠道内源性排出锌量（EFZ）。从理论上说，处于生长期的幼儿应该保留一定量的锌以满足生长所需，也就是TAZ应该高于EFZ约0.3mg/day，因此出现这一结果不能排除有实验误差。然而由于本研究中的幼儿绝大部分膳食锌摄入偏低，而且实际吸收锌量也偏低，出现这一结果也是完全有可能的。在其他的婴儿和儿童的研究中也曾出现同样的结果，特别是在低锌摄入的婴幼儿中[7]。
采用FNB推荐的因素分析[1],计算得到该年龄幼儿锌的生理需要量约为1.09mg/day，这一数值高于FNB根据成人数据推算的0.74mg/day。造成这种差异的重要原因是本研究中测定所得的幼儿的EFZ明显高于FNB从成人数据推算而来的数值，而EFZ是因素分析中的一个重要数据。造成EFZ数据误差的最大可能是幼儿大便收集不完整，但大便收集不完整所引起的误差是使EFZ降低，而不是本研究中偏高的结果。此外静脉注射剂量不正确也不影响EFZ。但是目前还不能完全排除肠道通透异常对EFZ所造成的影响[8]。
本研究估算得到该年龄幼儿锌的平均膳食需要量为3.3mg/day，也高于FNB估算值2.5mg/day[1]。在FNB估算幼儿锌的平均膳食需要量时，对膳食锌吸收率的估算为0.3，低于本研究实际测得的幼儿锌吸收率0.35。
锌吸收是一个主动饱和过程，而实际吸收锌量和膳食摄入锌量之间则呈饱和效应模式[9,10]。但在本研究中我们观察到实际吸收锌量与膳食摄入锌量呈直线相关性（图2）。在其他膳食锌摄入量偏低的人群中我们也有类似的发现[9,10]。
在本次研究中，除了一名幼儿，其他参加研究幼儿的膳食锌摄入量都低于FNB估计的该年龄幼儿的平均膳食需要量，实际吸收锌量也都低于FNB计算的生理需要量。如果和本研究计算得到的平均膳食需要量和生理需要量来比较则相差更大。参加本次研究的幼儿不仅膳食摄入锌量明显不足，同时幼儿的血浆锌浓度普遍较低，有48.8%低于正常低限值[11]。这些结果提示，这些幼儿处于锌缺乏的边缘。
本研究是该年龄人群中第一个采用稳定性同位素的研究，有待于其他的研究结果进行比较。鉴于锌缺乏对儿童的生长发育有明显的不良影响，而本研究所得的幼儿锌的生理需要量和平均膳食需要量都比由成人数据所推算的值要高，有必要进一步研究制定符合该年龄的微量元素锌的膳食参考摄入量。
参考文献
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