达能营养中心第十届学术研讨会论文集

买淑鹏¹ 李晓山¹ 徐增光² 杨年红¹

 

（1华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生系，武汉,430030;2同济大学附属东方医院,上海,200120）

 

摘要:目的探讨不同膳食模式对大鼠脂肪组织AMP激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase, AMPK）表达的影响及其对肥胖影响的机制。方法高脂饲料喂养雄性SD大鼠实验组15周，按体重分为肥胖(DIO)和肥胖抵抗(DIOR)组，再将DIO组一半改用基础饲料喂养(DIOHF/LF)，另一半继续喂养高脂饮食(DIOHF)，DIOR组继续喂养高脂饮食；以基础饲料喂养组作对照(CF)。至第23周末过夜禁食处死动物，取脂肪组织，用RTPCR方法检测AMPKα1和AMPKα2mRNA表达水平，免疫印迹方法检测AMPKα蛋白水平。结果DIOHF组大鼠体重显著高于CF、DIOHF/LF及DIOR组(P＜0.05)，DIOHF/LF组大鼠体重高于对照组(P＜0.05)。各组间AMPKα1mRNA表达均无差异（P＞0.05），DIOHF组AMPKα2mRNA表达及AMPKα蛋白水平显著低于CF、DIOHF/LF及DIOR组（P＜0.05），而其余各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论脂肪组织AMPKα水平降低与饮食诱导大鼠肥胖密切相关，其中AMPKα2扮演重要角色。

关键词:AMP激活的蛋白激酶；脂肪组织；高脂饮食；肥胖；肥胖抵抗

 

研究表明，长期高脂饮食可引起代谢紊乱，导致肥胖，而脂肪组织在能量代谢平衡方面起关键作用。AMP激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase, AMPK）是最近发现的一种调节能量代谢的重要蛋白，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是由α、β、γ3个亚基构成的异三聚体，其中α亚基是催化亚基，对AMPK的活性起主要作用[1]。本文拟通过建立饮食诱导大鼠肥胖模型，并对肥胖大鼠进行不同的饮食干预，比较观察各组大鼠脂肪组织中AMPKα基因和蛋白表达水平，以探讨AMPK在饮食诱导肥胖中的作用及其对肥胖的影响机制。

1材料与方法

1.1 实验动物及喂养

雄性SD大鼠36只，体重160～170g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。饲料配方及动物饲养条件参照文献[2]。大鼠适应性饲养1周后，按体重随机抽取9只作对照组(CF)喂以基础饲料，其余27只大鼠喂以高脂饲料，至第15周末，将高脂喂养组中体重大于对照组体重x-+1.96s者(14只)定为肥胖(DIO)大鼠，体重小于对照组体重x-+1.0s者(7只)定为肥胖抵抗(DIOR)大鼠。另有6只体重介于二者之间，未纳入本次研究。DIO组再随机分为2组，1组改喂基础饲料饮食(DIOHF/LF)，另一组维持原高脂饲料(DIOHF)，CF及DIOR大鼠仍维持原饲料，各组继续喂养8周，至第23周末过夜禁食处死。

1.2 实验动物相关指标观察和组织样品收集

每日观察大鼠一般情况，记录给食量和撒食量，计算进食量，同时每周称体重。实验结束时，过夜禁食l0h断头处死，分离肾周脂肪组织，迅速置液氮中冻存，以备RNA抽提，再分离睾周、腰周脂肪组织，称重。

1.3 RNA提取及逆转录—聚合酶链反应

(RTPCR)

按Trizol（Promega公司）说明书从大鼠肾周脂肪组织提取总RNA，核酸蛋白测定仪测定RNA浓度，在25μl的反应体系中将3μg的RNA逆转录得到cDNA，进行PCR扩增。AMPKα1（207bp）引物序列：sense：5attggatttccgaagtattgatg3, antisense：5cctggtcttggagctacgtca3，反应条件，95℃预变性5min，94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 1min，循环35次，72℃ 10min；AMPKα2（213bp）引物序列：sense：5aggtgtaccgagctatgaagca3，antisense：5agcgctgaggtgttgaagaac3，反应条件，95℃预变性5min，94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 1min，循环35次，72℃ 10min。βactin(156bp)引物序列：sense：5catcactatcggcaatgagc3，antisense：5gacagcactgtgttggcata3，反应条件，95℃预变性5min，94℃ 1min，59℃ 45s，72℃ 1min，循环35次，72℃ 10min。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准分子量比较鉴定，用Biometra凝胶成像系统进行成像和图像分析，AMPKα1和AMPKα2mRNA表达水平用目的基因条带分别与βactin条带光密度值之比表示。

1.4 免疫印迹（Western blotting）

脂肪组织匀浆、离心提取蛋白上清液。用BioRad试剂盒蛋白定量(Lowry’s)法将蛋白水平调成一致，加上样缓冲液100℃变性5min，于12％聚丙烯酰胺凝胶电泳2h15min，转至硝酸纤维膜上。用5％脱脂奶粉室温封闭2h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h后显影成像分析。AMPKα一抗兔抗(美国Cell Signal Technology公司)1∶500，二抗羊抗兔（美国Sigma公司）1∶1500；内参αtublin一抗（美国Sigma公司）鼠抗1∶3000，二抗（美国Sigma公司）羊抗鼠1∶4000。AMPKα表达水平用目的基因条带分别与αtublin条带灰度值之比表示。

1.5 统计学处理

全部数据录入Microsoft Excel 2003，用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。数据以x-±s表示，多个样本均数间的比较采用方差分析。

2结果

2.1 不同膳食对大鼠体重的影响

如图1所示，高脂饲料喂养时DIO组大鼠与DIOR和CF大鼠之间的体重差异随喂养时间增长而逐渐增大，15周末，DIOHF/LF组与DIOR和CF间体重差异有统计学意义（P＜0.05），而DIOR和CF组间体重差异无统计学意义（P＞0.05）。低脂饮食干预8周期间，DIOHF/LF组体重增加低于其他各组，与DIOHF大鼠之间体重差异有统计学意义（P＜0.05），DIOR和CF组体重差异仍无统计学意义（P＞0.05）。第23周末，DIOHF组大鼠体重显著高于CF、DIOHF/LF及DIOR组(P＜0.05)，DIOHF/LF组大鼠体重高于对照组(P＜0.05)。

Fig.1The tendency of weight changes in different groups

 

2.2 各组大鼠脂肪蓄积能力比较

如表1所示，DIOHF组大鼠肾周、腰周、睾周脂肪湿重均显著高于CF、DIOHF/LF和DIOR组，三个部位总的脂肪湿重和脂体比也高于其他三组（P＜0.05），DIOR大鼠与对照组相比仅睾周和总的脂肪湿重有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 大鼠脂肪组织AMPKα mRNA表达水平

RTPCR结果显示CF、DIOHF/LF、DIOHF及DIOR组AMPKα1mRNA表达的相对比值分别为0.86±0.21，1.11±0.23，0.95±0.38，0.86±0.12（见图2），统计学结果显示均无差异（P＞0.05），各组AMPKα2mRNA表达的相对比值分别为0.32±0.02，0.30±0.05，0.20±0.01，0.28±0.06（见图3），DIOHF组显著低于DIOHF/LF、DIOR及CF组（P＜0.05），而其余3组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

 

Table 1Fat tissue deposits of different groups（x-±s）

Fig.3The expression of AMPKα2mRNA in adipose tissue of different groups

2.4 大鼠脂肪组织AMPKα蛋白水平

如图4显示，CF、DIOHF/LF、DIOHF及DIOR组AMPKα蛋白表达的相对比值分别为0.98±0.08，1.00±0.12，0.47±0.01，0.87±0.25，DIOHF组显著低于CF、DIOHF/LF及DIOR组（P＜0.05），而其余3组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

 

Fig.4The protein level of AMPKα in adipose tissue of different groups

 

3讨论

AMPK是“细胞能量监测器”，在保持细胞内能量平衡方面扮演了重要角色。AMP/ATP比值增加可使AMPK激活（需要AMPK Thr172位的磷酸化），而AMPK的活化可抑制ATP合成代谢，促进ATP分解代谢，如脂肪酸氧化[3]。目前对AMPK在肝脏和骨骼肌中的作用已有较多研究[4-8]。Watt等人报道，用饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸培养的L6骨骼肌肌管相对于对照组细胞增加了AMPK活性，同时，在脂肪酸干预过的细胞组促进了AMPK Thr172位磷酸化，并分别增加了后续脂肪酸氧化[7]。与骨骼肌相似，在肝脏AMPK激活后，通过抑制乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的活性降低丙二酰辅酶A的浓度来抑制脂肪合成，促进脂肪酸氧化[8]。关于脂肪组织的研究，Park等人观察到自主运动会引起脂肪组织中AMPK激活，从而促进了脂肪酸氧化，同时ACC活性急剧下降[9]。本研究通过建立饮食诱导大鼠肥胖模型，并对肥胖大鼠进行不同饮食干预后显示：DIOHF组大鼠脂肪组织AMPKα2mRNA表达和AMPKα蛋白水平显著低于CF、DIOHF/LF及DIOR组，而大鼠体重和脂肪组织的蓄积能力DIOHF组显著高于CF、DIOHF/LF及DIOR组，提示脂肪组织中AMPK的低表达不利于脂肪酸氧化，促使了脂肪合成和肥胖的发生，脂肪组织中AMPK对脂质代谢的机制很可能与其在肝脏和骨骼肌中扮演同样的角色。

研究显示，AMPKα2敲除小鼠与对照组小鼠相比，食物摄入量无差异的情况下，小鼠体重和脂肪组织的量均增加[10]，本次实验研究结果显示：DIOHF组与其它组相比AMPKα1和AMPKα2mRNA表达水平中仅AMPKα2mRNA表达下降，AMPKα1mRNA表达水平各组间并无差异，提示AMPKα2对脂肪组织的合成和代谢起着至关重要的作用，脂肪组织AMPK对能量代谢平衡的作用主要是通过AMPKα2实现的，同时AMPKα2表达下降很可能是饮食诱导肥胖的机制之一。同时，本次实验的研究结果还显示，低脂饮食干预有助于改善大鼠体重增加量、脂肪蓄积量和脂肪组织AMPKα的表达，而大鼠肥胖抵抗可能与AMPKα表达维持正常有关。总之，脂肪组织AMPKα水平降低与饮食诱导大鼠肥胖密切相关，而它是否与其在肝脏和骨骼肌中发挥完全相同的作用及它对肥胖影响的具体机制有待进一步研究。

参考文献

[1] Kahn BB, Alquier T, Carling D,et al. AMPactivated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism[J]. Cell Metab, 2005,1:15-25.

[2] 王重建，杨年红，许明佳，等.高脂饮食诱导大鼠肥胖易感性差异的研究.华中科技大学学报(医学版)[J],2005,34(1)：65-68.

[3] Xue BZ, Kahn BB. AMPK integrates nutrient and hormonal signals to regulate food intake and energy balance through effects in the hypothalamus and peripheral tissues[J]. The Journal of Physiology, 2006,574:73-83.

[4] Martin TL, Alquier T, Asakura K, et al. Dietinduced Obesity Alters AMP Kinase Activity in Hypothalamus and Skeletal Muscle[J]. J. Biol. Chem,2006,281:18933-18941.

[5] Yamauchi T, Kamon J, Minokoshi Y, et al. Adiponectin stimulates glucose utilization and fattyacid oxidation by activating AMPactivated protein kinase[J]. Nature Medicine, 2002,8:1288-1295.

[6] Zhu MJ, Ford SP, Nathanielsz PW, et al. Effect of Maternal Nutrient Restriction in Sheep on the Development of Fetal Skeletal Muscle[J]. Biology of Reproduction,2004,71:1968-1973.

[7] Watt MJ, Steinberg GR, Chen ZP, et al. Fatty acids stimulate AMPactivated protein kinase and enhance fatty acid oxidation in L6 myotubes[J]. The Journal of Physiology, 2006,574:139-147.

[8] Assifi MM, Suchankova G, Constant S, et al. AMPactivated protein kinase and coordination of hepatic fatty acid metabolism of starved/carbohydraterefed rats[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2005, 289:E794-E800.

[9] Park H, Kaushik VK, Constant S, et al. Coordinate regulation of malonylCoA decarboxylase,snglycerol3phosphate acyltransferase, and acetylCoA carboxylase by AMPactivated protein kinase in rat tissues in response to exercise[J]. J Biol Chem, 2002,277:32571-32577.

[10] Villena JA, Viollet B, Andreelli F, et al. Induced adiposity and adipocyte hypertrophy in mice lacking the AMPactivated protein kinasealpha2 submit[J].Diabetes,2004,53:2242-2249.