达能营养中心第十届学术研讨会论文集

张文青 张月明¹

（山西医科大学第二医院，太原，030001；1新疆医科大学公共卫生学院，乌鲁木齐，830054）


摘要：目的研究抗性淀粉（RS）对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的干预作用。方法将40只Wistar大鼠随机选取10只饲以基础饲料（正常对照组），其余30只食用红花油高脂饲料并进行腹腔链脲霉素（STZ）注射（模型组）。对诱导成2型糖尿病的大鼠随机分为三组，分别饲食高脂饲料（B组）、高脂RS饲料（C组）、单纯RS饲料（D组）；原基础饲料组为A组。继续喂养5周，观察RS对大鼠糖脂代谢、胰岛素敏感指数影响及肝、肾组织病理学变化。结果与糖尿病对照组（B组）相比，RS干预组（C组、D组）糖耐量各时间点血糖值及曲线下面积比明显下降；血胰岛素水平显著降低，而胰岛素敏感指数显著升高；血脂各项指标下降；肝脂肪变性明显减轻，肝糖原合成增加。结论RS可改善糖尿病模型大鼠的糖脂代谢紊乱，提高胰岛素敏感性，具有拮抗或减轻胰岛素抵抗的作用。

关键词：胰岛素抵抗； 抗性淀粉； 糖尿病大鼠； 干预


糖尿病是对人类健康损害最大、耗费社会医疗资源最多的慢性病之一，将成为本世纪重大的公共卫生问题和社会问题。研究表明[1]，胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）在糖尿病的发生发展中起着极其重要的作用，并且在肥胖症、高血压和心脑血管疾病中扮演着重要角色，探讨IR的机制及其改善措施是近年来国内外研究的热点，也是防治2型糖尿病关键所在和最新治疗策略。为此，我们在前期实验已证实Hi-maize 1043抗性淀粉（resistant starch ,RS）可改善大鼠中红花油诱导的胰岛素抵抗的基础上[2]，进一步观察RS对2型糖尿病大鼠IR的干预作用，为RS的临床应用提供实验和理论依据。

1 材料与方法
1.1 动物与饲料
1.1.1 动物来源
Wistar雄性大鼠40只，体重170～190克，清洁级，由新疆医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 饲料
由中国医学科学院实验动物研究所配制，分为基础饲料（N）、高脂饲料（F）、高脂RS饲料（HS）和单纯RS饲料（LFS）4种，均为化学纯合饲料，配方如表1。高脂饲料和高脂RS饲料中蛋白质、碳水化合物和红花油提供的能量之比为15/26/59[3]。 基础饲料根据AIN-93标准[4]配制，用Hi-maize 1043替代基础饲料的部分玉米淀粉即为单纯RS饲料，两者均不含红花油。Hi-maize 1043抗性淀粉由国民淀粉上海有限公司提供，是一种玉米来源的天然淀粉。


1.1.3 分组和喂养
根据体重随机选取10只大鼠饲以基础饲料（正常对照组），其余30只食用高脂饲料（模型组），饲养10周后，模型组大鼠进行腹腔链脲霉素（STZ）注射，72小时后进行葡萄糖耐量试验（GTT），并取3只正常大鼠、4只模型大鼠麻醉处死，取胰腺作病理切片。对空腹血糖大于7.8mmol/L和餐后 2h血糖大于11.1mmol/L的大鼠，按体重和胰岛素敏感指数均衡原则随机分为三组，每组7只，分别饲食高脂饲料（B组即糖尿病对照组）、高脂RS饲料（C组即高脂RS干预组）、单纯RS饲料（D组即单纯RS干预组）；原基础饲料组为A组（正常对照组）。继续喂养5周后，再次进行GTT试验，并测量血脂、血胰岛素，观察RS对2型糖尿病大鼠的干预作用。



1.2 测量指标与方法
1.2.1 葡萄糖耐量试验（GTT）：试验前1日晚8时，动物禁食。试验当日晨7时，称重后经尾尖采空腹血，测血糖及血胰岛素。20%葡萄糖溶液灌胃（10ml/kg.bw）,并开始计时，于灌胃后15、30、60、90和120min分别采血。采用美国雅培公司生产的“安妥”血糖仪进行测量血糖，糖耐量曲线下面积比（AUC）采用几何面积相加法。
1.2.2 血胰岛素：放射免疫法，试剂盒由北方生物技术研究所生产，美国产DPL Gambyt CR 10放免仪。
1.2.3 胰岛素敏感性指数：根据李光伟方法[5]，计算胰岛素敏感性指数（ISI）。计算方法为： ISI等于空腹血糖与空腹胰岛素乘积的倒数。
1.2.4 血脂：经尾尖采血，自然凝固后分离血清，用BECMAN全自动生化分析仪测定总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低高密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。 1.2.5 胰腺病理切片
高脂饲料喂养10周后，取3只正常大鼠、4只模型大鼠麻醉处死，取胰腺用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色，Olympus PM-10AD生物显微镜观察摄影。
1.2.6 肝、肾组织病理切片
实验末大鼠处死后，取肝组织用纯酒精固定，常规石蜡包埋，肝糖原染色；取肾组织用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，六胺银染色，Olympus PM-10AD生物显微镜观察摄影。
1.3 统计学方法
采用spss for windows 11.0软件进行统计分析。实验数据均采用x-±s表示，组间比较采用one-way ANOVA方差分析。

2 结果
2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立
模型组30只大鼠饲用红花油高脂喂养10周后，腹腔注射STZ（溶于0.1M的柠檬酸缓冲液，pH4.4；注射体积：10 ml/kg；注射剂量：25mg/kg；STZ浓度：2.5mg/ml）[6]，大鼠禁食12小时尾尖采血，进行OGTT试验。结果发现，高脂组动物的空腹血糖均在10mmol/L以上，餐后2h血糖均在20mmol/L以上，并有多食、多饮、多尿，体重明显下降表现（结果见表2）。胰腺病理切片显示（见图1）：正常大鼠胰岛结构完整、胰岛内细胞形态结构正常，无异常物质沉积；模型大鼠胰岛内细胞形态结构破坏，细胞核数量减少，有粉红色淀粉样物质沉积。此为2型糖尿病的胰岛病变，故此认为已在大鼠中诱导出2型糖尿病。

2.2 RS对大鼠体重（BW）的影响（见表2）

经高脂饲料喂养加腹腔注射STZ后，2型糖尿病模型大鼠体重明显低于对照组（p＜0.05）。经5周的RS干预喂养后，各糖尿病组大鼠的体重依然明显低于对照组（A组）（p＜0.05），C组大鼠体重虽然低于A组，但却显著高于B组和D组（p＜0.05）。

2.3 RS对大鼠葡萄糖耐量与曲线下面积比
的影响（见表3）


经5周RS干预饲养，RS干预组（C组、D组）大鼠糖耐量各时间点血糖值较糖尿病对照组（B组）明显下降（p＜0.05），比正常对照组（A组）升高，但无统计学意义（p＞0.05）。糖耐量曲线下面积比（AUC）C组、D组大鼠较B组显著降低(p＜0.05)，与A组比较无差异。C、D两组之间各指标未产生差异。


2.4 RS对大鼠血胰岛素（FIN）及胰岛素敏感指数（ISI）的影响（见表4）

从表4数据可见，实验末RS干预组（C组、D组）大鼠血胰岛素水平与糖尿病对照组（B组）相比显著降低（p＜0.05），与A组比较无差异。胰岛素敏感指数C组、D组大鼠较B组显著升高（p＜0.05），与A组比较无差异。C、D两组相比未产生差异。

2.5 RS对大鼠血脂的影响（见表5）
RS干预5周后，干预组（C组、D组）大鼠血总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）浓度显著低于糖尿病对照组（B组）（p＜0.05），但与A组无差异。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）干预组显著低于B组并高于A组（p＜0.05）。高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）干预组（C组、D组）较B组有所升高，但无统计学意义。C、D两组相比上述各指标均无显著差异。
2.6 肝、肾组织病理学观察（见图2、3）
肝组织病理切片观察：A组大鼠肝细胞形态结构正常，胞浆内粉红色肝糖原丰富；B组大鼠肝细胞有明显的变性、肿胀，胞浆内粉红色肝糖原消失；C组大鼠肝细胞变性、肿胀较B组明显减轻，肝糖原较B组明显增加，肝细胞胞浆内可见脂肪滴存在；D组大鼠个别肝细胞胞浆内有少量脂肪滴外，细胞索排列整齐，肝糖原较B组丰富。
肾组织病理切片观察：A组大鼠肾小球毛细血管基底膜及血管系膜无增生，血管腔无狭窄；B组大鼠肾小球毛细血管基底膜增厚，血管系膜增生，肾小囊变宽；RS干预组（C组、D组）大鼠基底膜及血管系膜增生较B组有所减轻。

3 讨论
胰岛素抵抗（IR）及胰岛β细胞功能的缺陷乃为2型糖尿病发病的病理学基础。在IR早期，胰岛细胞代偿性分泌过多的胰岛素，产生高胰岛素血症，此时血糖可完全控制正常。但随着IR加剧，即使额外分泌大量胰岛素也不能抑制空腹及餐后血糖的升高，最后胰岛β细胞终因长期高血糖的毒性作用，负荷过重而衰竭。2型糖尿病患者胰岛素水平正常或升高，但其血糖水平得不到有效控制，表现为糖耐量异常，空腹血糖升高，高脂血症等IR特征。此外，2型糖尿病由于IR胰岛β细胞分泌更多的胰岛素来代偿，胰岛素β链分解产物增加，在胰岛内形成较多的淀粉样物质沉淀。本实验所用动物模型符合以上特点，表明2型糖尿病大鼠模型制作是成功的。

2型糖尿病IR主要表现在肝脏、肌肉和脂肪组织，肝脏IR表现为肝糖原输出增加，是引起空腹高血糖的主要原因。本实验干预组大鼠肝糖原较糖尿病对照组明显增加，表明RS可减少肝糖原分解，减少肝糖原输出，减轻肝脏胰岛素抵抗，使血糖下降。其机制可能为：RS能抵抗淀粉酶的消化，基本上完全通过小肠进入大肠，结肠中完全发酵重吸收的特殊代谢方式，使餐后血糖以缓慢而持续的速度增加。RS也是一种不溶性纤维，没有粘滞性，在结肠微生物的作用下发酵，释放出有代谢活性的短链脂肪酸（主要是乙酸、丙酸和丁酸）。这些短链脂肪酸可被结肠上皮细胞利用和通过肝门静脉进入血循环，影响脂肪组织中的脂肪分解、肝脏糖异生和胰岛素分泌[7]。最新研究显示[8、9]，门静脉的短链脂肪酸浓度增加对肝脏代谢有影响，如增加肝细胞与胰岛素结合。丙酸有胰岛素样作用，可刺激糖酵解、激活离体肝细胞的糖原合成、减少糖异生，从而降低血糖。本实验结果符合以上观点。
IR存在时，肝脏正常的生理活动受到影响，使游离的脂肪酸（FFA）及TG合成增多，而FFA和TG又会降低胰岛素的敏感性，从而造成脂质代谢紊乱的恶性循环。2型糖尿病伴发高脂血症的机制在于其存在着IR，而IR可以直接导致脂代谢紊乱[10]。首先，脂肪细胞膜上受体对胰岛素敏感性下降，使抗脂的作用减弱，大量的脂肪酸释放入血，为TG合成提供了丰富的原料。其次，肝脏脂蛋白酯酶活性降低，肝脏摄取极低密度脂蛋白（VLDL）代谢的残粒减少，TG清除障碍；同时，VLDL-C向HDL-C的转化受阻，导致HDL- C降低。再次，LDL的载脂蛋白E（ApoE）糖化，使LDL-C经其受体途径清除作用减弱。因此，脂质代谢紊乱常以TC、TG增高，HDL-C水平降低，LDL-C和VLDL-C水平升高为特征[7、3]。本实验中首先采用红花油高脂饲料喂养大鼠诱导出胰岛素抵抗，再联合小剂量STZ腹腔注射造成2型糖尿病大鼠模型，模型组大鼠血糖、TC、TG、LDL-C明显增高，HDL-C明显降低，其血脂含量改变与实验理论相吻合，符合临床2型糖尿病特征。当经过RS干预实验5周后，干预组大鼠TC、TG及LDL-C较对照组明显降低，HDL-C较对照组有所升高。故此认为RS具有改善2型糖尿病大鼠脂代谢紊乱的作用。
本实验所采用的反映胰岛素敏感性的指标为ISI[11]，与世界公认的金指标“胰岛素钳夹技术”高度相关，但又较其简便易行，实验结果显示，RS可明显提高糖尿病模型大鼠的ISI，从而增加胰岛素敏感性，降低胰岛素抵抗。
参考文献
[1] Goldstein BJ. Insulin resistance as the core defect in type 2 diabetes mellitus[J]. Am J Cardiol.2002,90: 3G-10G.
[2] 王红伟，韩军花，张文青等. 抗性淀粉对大鼠胰岛素抵抗的影响[J].营养学报.2007,29（2）:131~133.
[3] Zhang FL, Ye CZ, LI G, et al. The rat model of type 2 diabetic mellitus and its glycometabolism characters[J]. Exp Anim. 2003, 52:401-407.
[4] Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American institute of nutrition Ad Hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J]. J Nutr. 1993,123:1939-1951.
[5] 李光伟, 潘孝仁, Lillioja R. 检测人群胰岛素敏感性的一项新指数[J]. 中华内科杂志.1993,32:656-660.
[6] Reed MJ, Meszaros K, Entes LJ, et al. A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozotocin-treated rat[J]. Metabolism. 2000,49: 1390-1394.
[7] Venter CS, Vorster HH, Cumming JH. Effects of dietary propionate on carbohydrate and lipid metabolism in healthy volunteers[J]. Am J Gastroenterol.1990,85:549-553.
[8] Janine AH. Resistant starch: metabolic effects and potential health benefit[J]. Journal AOAC international. 2004,87(3):761-768.
[9] Linda CT. Diet and metabolic syndrome: where does resistant starch fit in[J]. Journal AOAC international. 2004,87(3):756-760.
[10] 千正琦, 沈更新, 金惠玲. 2型糖尿病脂肪肝与胰岛素抵抗脂代谢的关系[J]. 浙江临床医学. 2002,7(5):270-271.
[11] 李光伟. 胰岛素敏感性评估及在临床研究中的应用[J]. 中华内分泌代谢杂志. 2000,16:198-200.