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    2.2 结肠益生菌减少是乳糖不耐受发生的重要原因

    乳糖酶缺乏（LD）是乳糖不耐受发生的基本原因，但不是其唯一原因。根据对LI者胃和小肠因素的分析结果，初步推论LI者摄入一定量乳糖之后出现不同严重程度症状（如无腹泻或腹泻）的主要原因很可能与结肠菌群对乳糖的进一步代谢有关。
    （1）LI者结肠菌群构成分析：传统的细菌培养法耗费时间，对培养基以及培养的微生物有严格要求，因此很难准确反映人肠道复杂的微生物构成。荧光原位杂交技术（FISH）方法是一种不依赖于细菌培养法而能对结肠菌群进行准确定量、定性测量的方法。本部分研究采用FISH技术分析LM和LI个体的结肠细菌总数和几组结肠主要菌群的数量。
    （2）结肠菌群与LI的关系：结肠菌群在LI发生过程中可能具有重要作用，尤其是那些能够发酵乳糖的结肠细菌，如双歧杆菌、乳酸杆菌、部分拟杆菌、真细菌等，这些细菌的β半乳糖苷酶活性可以达到其他非乳糖发酵细菌的4倍。一般情况下，每个个体肠道菌群的构成是相对恒定的，但个体间存在一定差异，所以对乳糖的发酵分解能力不同，对一定剂量乳糖的耐受性也不相同，以致产生不同的临床症状。
    （3）双歧杆菌与LI的关系：大量关于益生菌的研究结果都支持双歧杆菌在防治LI发生中的重要作用，该菌发酵乳糖产生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等短链脂肪酸，而不产生H2等肠道气体，因此在发酵进入结肠的乳糖时不会因产气过多而引起腹胀等不适症状。本研究结果显示绝大多数受试者粪便样本的双歧杆菌数量相当低，38％（6/16）的LIa组对象，45％（5/11）的LIb组对象未检出双歧杆菌；LIa组双歧杆菌数量变化范围为0~195×109，LIb组为0~342×108，LIa组数量的中位数值高于LIb组，但两组之间没有检出显著性差异（见表2，表3），可能与实验对象双歧杆菌数量太低有关。

    在同样条件下荷兰Groningen大学微生物实验室（本课题合作实验室）对11名荷兰实验对象粪便双歧杆菌检测结果显示，平均数量为16×109（范围为88×108~13×1010），占细菌总数的百分比为054％~438％。该结果提示本课题中LI受试者结肠双歧杆菌数量普遍较低，可能是发生LI症状的一个重要原因。双歧杆菌数量低与饮食习惯密切相关，中国人与荷兰人相比在饮奶习惯上存在很大差异，前者的饮奶率和饮奶量都远远低于后者。
    （4）其他菌群与LI的关系：通过采用FSIH技术对受试者的结肠菌群进行分析，发现LI症状评分（symptom score,SSC）与细菌总数，与Eubacterium rectale/Clostridium coccoides（Erecgroup）细菌组之间呈显著性负相关关系（见图1，表4），Erecgroup细菌组是包括梭状芽孢杆菌属、真细菌属在内的一组细菌，是结肠内的一组优势菌，该组细菌数量与细菌总数呈显著性正相关。
    通过比较LIa组与LIb组的细菌总数和所分析的各主要菌群数量，发现LIa组均高于LIb组，但未检出统计学显著性差异，可能与个体之间数量上存在差异较大有关，细菌数量的变异系数CV从43%到88%。在一项以荷兰人群为受试对象的研究中作者也发现个体之间在细菌构成上存在较大的变异度（20%~60%），提示结肠菌群构成的差异普遍存在于人群中。



图1Erect482探针计数所得Eubacterium rectale/Clostridium coccoides
细菌组与SSC之间的相关关系分布

Fig1The relation of the individual number of Eubacterium rectale/Clostridium
coccoides group detected by Erect482 probe and the SSC

表4LI组的SSC与细菌总数和各组细菌数量及其百分比数量的相关关系分析（n=27）

    本研究结果表明，结肠中双歧杆菌数量低与中国人LI症状的发生有密切关系，而结肠细菌总数增高，特别是Erec482探针计数所得的Erecgroup细菌组的细菌数量增高与LI症状评分呈负相关。
以上研究结果表明，结肠中双歧杆菌数量低与中国人LI症状的发生有密切关系，而结肠细菌总数增高，特别是Erec482探针计数所得的Erecgroup细菌组的细菌数量增高与LI症状评分呈负相关。

    3 乳糖不耐受与饮奶

    3.1 乳糖不耐受限制奶摄入量

    （１）中国人乳糖不耐受发生率高：欧洲、北美或澳大利亚人乳糖酶缺乏发生率通常低于30%，亚洲和非洲人却高达75%~100%，中国汉族成人乳糖酶缺乏的发生率为75%~957%；婴儿在断母乳以前，乳糖酶的活性较高，它能分解母乳中的乳糖。尽管其乳糖含量是牛奶的15倍，但哺乳期的婴儿发生乳糖不耐受的情况很少。两岁以后乳糖酶活性急速降低，尤其在不喝牛奶的儿童中。牛奶不耐受发生率比乳糖不耐受发生率低，成都市区成人乳糖酶缺乏发生率为92%，乳糖不耐受发生率为624%；牛奶不耐受发生率仅为39%。
    （２）中国人牛奶摄入量低：1992年全国营养调查结果，我国每标准人平均每日奶及其制品的消费量仅为146g，不到西方国家饮奶量(06L/d)的5%，每日人均钙摄入量为4052mg，大约仅为成人钙适宜摄入量的一半。中国人低奶摄入量很大程度上与乳糖不耐受有关。

    3.2 祖孙三代乳糖不耐受发生率的差异

    （1）53户资料：三代人中父母、祖父母和外祖父母（至少3人）均参加试验的家庭有53户，其中祖、父母两代均不饮奶的家庭有16户；祖、父母两代部分饮奶的家庭有27户；祖、父母两代均饮奶的家庭有10户。用校正检验，确切概率法分析，结果为祖父母、父母两代均不饮奶的家庭中儿童乳糖不耐受发生率（882%）高于两代均饮奶（455%，P＜005）和两代部分饮奶家庭中儿童乳糖不耐受发生率（321%，P＜001），见表5。

    （2）7户资料：三代人中父母、祖父母和外祖父母（至少5人）均参加试验的家庭有7户。7户中，祖、父两代均不饮奶者有4户，其儿童全为LI，其中有2个儿童腹泻且为不饮奶者，另两个儿童饮奶仅为腹胀；其余3户有一半及其以上的祖、父两代均有饮奶者，其儿童均耐受牛奶。
以上调查结果表明，祖孙三代不饮牛奶与乳糖不耐受有关，祖父母、父母两代均不饮奶者，其儿童乳糖不耐受发生率约为两代均饮奶或部分饮奶者的两倍。

    3.3 乳糖不耐受危险因素分析

    对与成人饮奶有关的9个变量进行单因素分析后筛选出4个与乳糖不耐受发生的危险性有统计学意义的变量(文化程度、饮奶年数、饮奶频率、AMIy),以及P＜01的变量(一次饮奶量)进行Binary Logistic回归分析，以是否发生LI为结果变量，将筛选出的变量作为自变量，用Binary Logistic回归模型分析结果为：饮奶年限、饮奶频率、一次饮奶量对不耐受发生的危险性有影响，差异有统计学意义（P＜005）。饮奶年限和饮奶频率与乳糖不耐受发生的危险性呈负相关，OR分别为0317、0465；一次饮奶量与乳糖不耐受发生的危险性呈正相关,OR为6337。文化程度、AMIy未进入方程。（表6）

    3.4 长期多代不饮奶对BALB/c小鼠小肠乳糖酶活性的影响

    将3周龄断乳小鼠分为2组，饮奶组用牛奶灌胃，断奶组用蒸馏水灌胃。一般在70天成熟，分笼饲养当天即行交配（当天或第二天就发现阴栓形成，也有个别例外），18天产仔。通过三代繁殖多代饮牛奶或不饮牛奶，观察BALB/c小鼠小肠乳糖酶活性的变化，结果发现：①无论在断奶组或饮奶组，亲代不同年龄段小鼠小肠黏膜乳糖酶活性均不同，其中3周龄鼠乳糖酶活性最高，5、7周龄显著下降，9周龄最低，说明小鼠在断乳后，乳糖酶活性随年龄增大而明显下降。②子一代小鼠与亲代相似，均呈现成年后乳糖酶活性下降的现象；且相同年龄组两代之间无统计学差异，断奶组或饮奶组之间也无统计学差异。③饮奶组子二代7周龄小鼠乳糖酶活性与3周龄小鼠无统计学差异；而显著高于饮奶组亲代7周龄小鼠和断奶组7周龄小鼠乳糖酶活性（P＜005），说明三代长期饮奶能使子二代7周龄小鼠乳糖酶活性维持在一定水平，而三代均不饮牛奶可使其子二代小鼠乳糖酶活性降低。所有结果见表7。此实验结果为长期不饮牛奶导致乳糖酶活性降低以及长期饮牛奶可维持乳糖酶活性找到了直接的证据。

    3.5 四种不同饮奶方式对乳糖不耐受发生率的影响

    由表8可见，100名对象用四种不同饮奶方式，不耐受症状的发生率不同明显不同。早餐空腹饮奶LI症状发生率最高（276％），午、晚餐饮奶LI症状发生率最低（137％），两者有显著差异（χ2＝6156，P＜005）。可以认为正餐饮奶LI不耐受症状发生率低于早餐空腹饮奶。

表7BALB/c小鼠三代各年龄乳糖酶活性（U/ml匀浆）

Table 7The differences of lactase activities
(U/ml homogenate) among BALB/c mice with
 different ages in 3 generations

表8四种不同饮奶方式LI症状发生率的比较

Table 8The prevalence of the symptom in different milk drinking manner

    在调查对象中，平时饮奶出现症状的17人中有13人完成整个调查，他们在早餐空腹、早餐混食、午餐或晚餐混食和午餐或晚餐2小时后饮奶的不耐受症状的发生率分别为100％、539％、385％、462％（表2-7）。早餐空腹LI不耐受症状的发生率高于正餐饮奶和午、晚餐2小时后饮奶（P均＜005），差异有统计学意义。
    午、晚餐饮奶在降低牛奶不耐受症状的发生率上优于早餐饮奶。本次调查结果显示：早餐饮奶LI发生率为237％，午、晚餐饮奶LI发生率为137％。同为正餐饮奶，但出现LI发生率差异大，其原因是饮奶时摄入的食物种类和数量不同。早餐一般进食量较小，胃排空时间较短；早餐食物种类较少，多吃面食（如包子、面包、馒头）和鸡蛋，午、晚餐一般多为米饭、面条、豆类、蔬菜及肉类，食量均比早餐大。

    3.6 与其他进食的食物有关

    根据氢呼气试验结果，结合粪便中乳糖含量及受试者平时的饮奶情况，筛选出8名平常不饮奶、氢呼气试验和粪便乳糖阳性、并出现水样腹泻的严重乳糖不耐受者。应用2因素2水平的正交表设计牛奶与不同食物（馒头、鸡蛋、锅魁、面包、全麦面包）的配膳方案，每人每次饮用含25g奶粉的牛奶溶液200ml,每人早餐进食量按8kcal/(kgbw)计算（正常体重成人按40kcal/(kgbw)计，早餐占总能量的20%~25％）。结果显示，饮牛奶时搭配的食物如鸡蛋、馒头、锅魁、面包等可延缓胃排空，减轻不耐受症状；牛奶与鸡蛋、固体食物（如锅魁）效果更好；含膳食纤维高的食品，非但不能减低、还会加重不耐受症状。

    3.7 饮酸奶结肠β半乳糖苷酶活性显著升高

    LI者能够更好耐受酸奶的另一个原因是酸奶中活菌所具有的β半乳糖苷酶，保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌都可以合成该酶，其酶活性与非乳糖发酵菌相比高4～5倍。酸奶中的β半乳糖苷酶可以消化其所含的乳糖，使进入肠内的乳糖量降低；同时也增加了肠内的β半乳糖苷酶活性，有利于乳糖在小肠内的分解吸收和结肠内的发酵作用。
    本研究在给予干预措施后结肠β半乳糖苷酶活性显著升高，干预结束后1周酶活性均值仍高于基础值（见图2），说明来自酸奶或益生菌胶囊的β半乳糖苷酶没有被胃酸、消化酶以及胆盐完全破坏，能够进入结肠并保持活性，对分解乳糖、减轻LI症状有重要作用。

    4 合理饮奶

    1．增加乳糖酶：每天饮酸奶，增加乳糖酶含量，或在牛奶中加入乳糖酶，以促进乳糖的分解；
    2．减缓乳糖的吸收：喝奶时摄入馒头、鸡蛋、锅魁、面包等能延缓消化吸收的食物，以减缓乳糖的吸收；
    3．摄入适量牛奶：摸索适合于自己的牛奶摄入量，为了防止乳糖不耐受发生，不要喝太多牛奶，为了增加优质钙的摄入要坚持喝奶，不要喝太少奶甚至不喝牛奶。
    4．吃饭喝奶，不要空腹喝奶。

图2益生菌和酸奶干预前、干预期间和干预后结肠β半乳糖苷酶的活性水平

Fig2The mean βgalactose activity of fecal samples for each volunteer during basal,
intervention and post intervention periods