达能营养中心在全球

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达能营养中心第四届学术研讨会论文集

高压液相色谱法测定牛乳中土霉素、四环素的残留
刘敏捷1 师邱毅1 贾玉珠2 赵瑛2 郝丽荣2
1.内蒙古自治区卫生防疫站
2.包头市卫生防疫站
（呼和浩特市锡林南路136号 邮编：010020）

　　抗生素在畜禽等生物防病中起着重要作用，但如果过量或使用不当会产生一些毒副作用，甚至危害到人体健康。牛乳是我国广大婴幼儿、孕妇、病人及健康人群的常用食品，因其营养价值高，营养成分齐全，并且容易消化吸收，在预防和缓解疾病中有着极为重要的作用。但目前我国对牛乳中的抗生素残留还未制定标准，亦没有标准检验方法。为了能够准确测定出牛乳中的四环素、土霉素的含量，我们摸索了以盐酸为介质，采用高压液相色谱同时测定牛乳中四环素、土霉素的方法，获得满意结果，本方法的最低检出限分别为：四环素0.1ug/mL，土霉素0.07 ug/mL。

关键词：牛乳、土霉素、四环素。
1.实验原理：
　　样品经盐酸介质提取，经0.45um微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱柱分离，紫外检测器检测，与标准系列比较峰高定量，出峰顺序为土霉素、四环素。
2.试剂：
2.1.土霉素（OTC）标准溶液：称取土霉素标准品（中国药品生物制品检定所提供，0487-200001，含量92.4%）0.0108g，用0.1moL/L盐酸溶解并定容至10.0 mL，相当于每毫升含土霉素1.000mg。
2.2.四环素（TC）标准溶液：称取四环素标准品（中国药品生物制品检定所提供，0488-200001，含量98.7%）0.0101g，用0.1moL/L盐酸溶解并定容至10.0 mL，相当于每毫升含四环素1.000mg。
2.3.混合标准溶液：取上述两种标液各1.0 mL，用10%HCl定容至10.0 mL。此溶液每毫升相当于含土霉素、四环素各0.100 mg，临用时现配。
2.4.乙腈（色谱纯）：河北廊坊市兴科化工有限公司。
2.5.0.01 moL/L磷酸二氢纳溶液：称取15.6g磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）溶于蒸馏水中，定容到1000 mL。经0.45 um滤膜，用30%（V/V）硝酸调PH为2.5-2.8备用。
3.仪器：
3.1.日本岛津产LC-10AVP高效液相色谱仪，配CLASS-VP工作站，具有紫外检测器。
3.2.CX-100型超声波清洗机，北京市医疗设备二厂生产。
4.色谱条件；
　　色谱柱：YWC-C18 10 um不锈钢柱4.6mm (id)×250 mm；检测波长：355nm；柱温：35℃；流速；1.0 mL/min；进样量：10uL；流动相：A泵-0.01 moL/L磷酸二氢纳溶液（PH为2.5-2.8），0.65 mL/min；B泵-乙腈，0.35 mL/min。两流动相在使用前超声脱气10 min以上。
5.样品预处理：
　　取2.5 mL牛乳，加2.5 mL10%（V/V）盐酸振摇2 min，移入离心管中，以3000转/ min离心3 min。取上清液经0.45 um针式滤膜过滤，滤液备用。
6.标准工作曲线的制作：
图1
图1为TC标准曲线，浓度为5 ug/ mL、10 ug/ mL、15 ug/ mL。
图2

图2为TC标准曲线，浓度为20 ug/ mL、30 ug/ mL、50 ug/ mL。
图3

图3为OTC标准曲线，浓度为5 ug/ mL、10 ug/ mL、15 ug/ mL。

图4
图4为OTC标准曲线，浓度为20 ug/ mL、30 ug/ mL、50 ug/ mL。
7.讨论：
7.1.流动相的选择：
用乙腈和0.01 moL/L磷酸二氢纳溶液的多种比例进行试验，发现乙腈浓度为35%时为最佳比例。一般情况下乙腈的比例控制在32%-40%之间。
7.2.柱温的选择：
柱温的高低对分离速度和柱压都有影响。本实验我们选定柱温为35℃（高于室温10℃左右），以利于保留时间和峰高的稳定，使分离不受温度波动的影响，并降低柱压。
7.3.PH的选择：
本实验中，PH值对测定结果影响很大，如果PH值太低即小于2.0时，会损害色谱柱，如果PH值偏高即大于3.0时，两峰无法分离。所以，本实验的PH值控制在2.5-2.8之间。
7.4.精密度试验：
在同一份牛乳中加入土霉素和四环素标准质其含量为10 ug/mL。两天测定六次（样品处理后很容易分解，放置时间不宜超过两天），结果见表1
表1 精密度试验
样品
1
mg/L
2
mg/L
3
mg/L
4
mg/L
5
mg/L
6
mg/L
R.S.D
土霉素
12.13
12.18
10.86
11.96
11.33
12.03
4.54%
四环素
10.50
10.57
9.72
10.30
10.11
10.42
4.73%

7.5.回收率实验：
以牛乳作本底样品，添加三种浓度标准液，使定容后的液体含标准浓度分别为2.5ug/mL、10.0ug/mL、30.0 ug/mL，测得的回收率见表2。由表2可以看出，土霉素回收率在78.0-98.0%之间，四环素在84.0-95.7%之间。
表2 回收率实验
样品
本底值mg/L
加标值mg/L
测定值mg/L
回收率
土
霉
素
2.0
30.0
31.40
98.0
2.0
10.0
11.33
93.3
2.0
2.5
3.95
78.0
四
环
素
0.0
30.0
28.71
95.7
0.0
10.0
9.72
92.7
0.0
2.5
2.10
84.0
7.6.方法检出限：
按3倍噪音计算，土霉素、四环素的最低检出浓度分别为0.07 ug /mL，0.10 ug /mL。
7.7.主要干扰因素：
通过实验我们发现下列问题会直接影响到测定结果。
⑴ 由于土霉素和四环素分解很快，特别是低浓度时，所以混合标准品必须临用现配，单标液冷冻不超过1周，这样就要求样品处理后应立即进样测定；
⑵ 目前国家标准GB/T14931.1-1994选用高氯酸作为提取剂来测定畜禽中抗生素的残留。实验中我们发现，高氯酸氧化性极强，对被测成份及分离柱均有严重损害，因而严重影响测定结果。本实验选用5%盐酸作为提取剂，测定结果令人满意；
⑶ 流动相和缓冲液的PH值对实验结果影响很大，流速太快或太慢都会影响两峰的分离，因此在实验过程中要严格控制流动相的流速和缓冲液的PH值；
⑷ 实验中发现两峰的保留时间比较近，分离度较差，所以计算时用峰高定量。
参考文献：[1]藤田和弘等 食品卫生学杂志 1997.38（1）
[2]GB/T14931.1-1994畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法（高效液相色谱法）
作者简介：刘敏捷，女，内蒙古自治区卫生防疫站副站长，主任医师，从事食品卫生、食品毒理专业二十余年，先后完成国家级、省部级科研课题多项，并在国家级杂志发表论文二十余篇。现为中国公共卫生杂志编委和内蒙古自治区预防医学会理事。